MM_FS_CNG_0516 食品添加剂叶酸

MM_FS_CNG_0516食品添加剂 叶酸

MM_FS_CNG_0516

食品添加剂叶酸

1.适用范围

本标准适用于化学合成法制得的叶酸，在食品工业中作为维生素类营养强化剂。

2.化学名称、分子式、结构式、分子量

化学名称：N-[4-[（2-氨基-1，4-二氢-4-氧代-6-蝶啶）甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸

N-[4-[（2-Amino-1，4-dihydro-4-oxo-6-pteridinyl）methyl amino]benzoyl]-L-glutamic Acid

分子式：C₁₉H₁₉N₇O₆

结构式：

分子量：441.40（按1987年国际原子量计）

3.技术要求

3.1.性状

本品为黄色或橙黄色结晶性粉末；无臭、无味。在水、乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶；在氢氧化钠和碳酸钠的稀溶液中溶解。

3.2.项目和指标

4.试验方法

4.1.鉴别

4.1.1.试剂

氢氧化钠：0.1mol／L溶液。

4.1.2.仪器设备

紫外分光光度计，附1cm比色池。

4.1.3.鉴别方法

取样品，加氢氧化钠溶液制成每1mL中含10μg样品的溶液，用紫外分光光度计测定，在256±2nm，283±2nm，365±4nm的波长处有最大吸收，吸收度256nm与吸收度365nm的比值应为2.8～3.0。

4.2.叶酸含量测定

4.2.1.第一法.比色分光法

4.2.1.1.试剂

氢氧化钠：0.1mol／L溶液；

盐酸：2mol／L溶液；

锌粉（无砷锌）；

亚钠：0.1％溶液；

氨基磺酸铵：0.5％溶液；

二盐酸萘基乙二胺：0.1％溶液；

对照品溶液的制备：称取叶酸对照品（同时测定水分）0.08g（准确至0.0002g），置100mL量瓶中，加氢氧化钠溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀（溶液A）。精密吸取溶液A 2mL，置另一100mL量瓶中，加盐酸溶液20mL，用水稀释至刻度，摇匀，即得。每1mL中约含叶酸对照品16 μg（溶液B）；

样品溶液的制备：称取叶酸样品，按对照品溶液的制备法制备，即得。

4.2.1.2.仪器设备

分光光度计，附1cm比色池。

4.2.1.3.测定方法

精密量取对照品溶液B与样品溶液B各60mL，分别置250mL具塞锥形瓶中，各加锌粉0.5g（可稍过量），连续振摇20min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，各精密吸取续滤液2mL，分别置10mL量瓶中，各依次加水3mL，盐酸溶液1mL与亚钠1mL，混匀，放置2min，各加氨基磺酸铵溶液1mL，混匀，放置10min，各加二盐酸萘基乙二胺溶液1mL，混匀，放置10min，用水稀释至刻度，摇匀。

另精密吸取对照品溶液A与样品溶液A各20mL，分别置100mL量瓶中，各加盐酸溶液20mL，用水稀释至刻度，摇匀。各精密吸取2mL，分别置于10mL量瓶中，自“依次加水3mL”起，依法操作；

另取水2mL置10mL量瓶中，自“依次加水3mL”起，依法操作，作为空白，用分光光度计测定，以1cm的比色池在550±1nm的波长处测定上述二组溶液的吸收度。

4.2.1.4.计算结果的表示

叶酸含量X₁（以质量百分数表示）按式（1）计算：

式中：A₁ —— 用锌粉还原的对照品溶液吸收度；

A₂ —— 用锌粉还原的样品溶液吸收度；

A₃ —— 未用锌粉还原的对照品溶液吸收度；

A₄ —— 未用锌粉还原的样品溶液吸收度；

m₁ —— 对照品质量，g；

m₂ —— 样品质量，g；

X₂ —— 对照品水分含量，％；

X₃ —— 样品水分含量，％。

注：X₂、X₃按4.3测定。

4.2.1.5.允许差

两次平行试验的相对偏差应小于2％。

4.2.2.第二法.高效液相色谱法

4.2.2.1.试剂

磷酸二氢钾；

氢氧化钾：0.1mol／L溶液；

甲醇（HPLC色谱级）；

烟酰胺（药用级）；

氨水：0.5％溶液；

叶酸对照品（中国卫生部生物制品鉴定所）。

4.2.2.2.仪器设备

高效液相色谱仪，附十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

4.2.2.3.系统适用性试验

以磷酸二氢钾6.8g与氢氧化钾液（0.1mol／L）70mL，加水稀释成约850mL并调节pH至6.3±0.1，加甲醇80mL，用水稀释成1000mL的溶液为流动相；检测波长为2nm，叶酸峰和内标物质峰的分离度应大于1.5。

分离度（R）按式（2）计算：

4.2.2.4.校正因子测定

取烟酰胺适量，加水溶解并稀释成为1mL中含1.0mg的溶液作为内标溶液；另称取叶酸对照品5mg（精确至0.00002g）置25mL量瓶中，加0.5％氨溶液约15mL溶解，精密加入内标溶液5mL，用同一溶剂稀释至刻度，摇匀，取10 μl注入液相色谱仪，计算校正因子。

校正因子（F₁）按式（3）计算：

式中：A₅ —— 烟酰胺的峰面积；

A₆ —— 叶酸对照品的峰面积；

m₃ —— 烟酰胺的质量，g；

m₄ —— 叶酸对照品的质量，g。

4.2.2.5.供试品溶液的制备与测定

取本品约5mg（精确至0.00002g），按4.2.2.4校正因子测定项下的叶酸对照品溶液的制备和测定。

4.2.2.6.计算结果的表示

叶酸含量X₄（以质量百分数表示）按式（4）计算：

式中：F₁ —— 校正因子；

A₇ —— 叶酸峰面积；

A₈ —— 烟酰胺峰面积；

m₅ —— 样品的质量，g；

m₆ —— 烟酰胺质量，g。

4.2.2.7.允许差

两次平行试验的相对偏差应小于2％。

4.3.水分的测定

4.3.1.试剂

费休氏试液：配制  称取碘(置硫酸干燥器内48小时以上)110g，置干燥的具塞烧瓶中，加无水吡啶160ml，注意冷却，振摇至碘全部溶解后，加无水甲醇300ml，称定重量，将烧瓶置冰浴中冷却，通入干燥的二氧化硫至重量增加72g，再加无水甲醇使成1000ml，密塞，摇匀，在暗处放置24小时。

    本液应遮光，密封，置阴凉干燥处保存。临用前应标定浓度。

    标定  用水分测定仪直接标定。或取干燥的具塞玻瓶，精密称入重蒸馏水约30mg，除另有规定外加无水甲醇2～5ml，用本液滴定至溶液由浅黄色变为红棕色，或用永停滴定法(附录WA)指示终点；另作空白试验，按下式计算。

式中: F——为每1ml费休氏试液相当于水的重量，mg；

      W——为称取重蒸馏水的重量，mg；

      A——为滴定所消耗费休氏试液的容积，ml；

      B——为空白所消耗费休氏试液的容积，ml。

无水甲醇；

三氯甲烷。

4.3.2.仪器设备

费休氏水分测定仪。

4.3.3.测定方法

称取样品0.1g（准确至0.0002g），置干燥的具塞玻瓶中，加三氯甲烷无水甲醇（4∶1）5mL，在不断振摇（或搅拌）下，用费休氏试液滴定至溶液由浅黄色变为红棕色。同法作空白试验。

4.3.4.计算结果的表示

样品中水分含量X₅（以质量百分数表示）按式（5）计算：

4.3.5.允许差

两次平行试验的相对偏差应小于0.2％。

4.4.炽灼残渣的测定

4.4.1.试剂

硫酸。

4.4.2.测定方法

称取样品1g（准确至0.01g），置于已在700～800℃炽灼至恒重的瓷坩锅中，用小火缓缓加热至完全炭化，放冷后，加硫酸0.5～1mL使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700～800℃下灼烧到恒重。

4.4.3.计算结果的表示

炽灼残渣X₆（以质量百分数表示）按式（6）计算：

式中：m₈ —— 坩埚加残渣质量，g；

m₉ —— 坩埚质量，g；

m₁₀ —— 样品质量，g。

4.5.重金属的测定

4.5.1.第一法 仲裁法

4.5.1.1.原理概要

在弱酸性（pH3～4）条件下，试样中的重金属离子与硫化氢作用，生成棕黑色，与同法处理的铅标准溶液比较，做限量试验。

4.5.1.2.主要试剂和仪器

4.5.1.2.1主要试剂

、硫酸、盐酸氨水；

6mol／L盐酸：量取50mL盐酸，用水稀释至100mL；

1mol／L盐酸：量取8.3mL盐酸，用水稀释至100mL；

6mol／L氨水：量取40mL氨水，用水稀释至100mL；

1mol／L氨水：量取6.7mL氨水，用水稀释至100mL；

pH3.5的乙酸盐缓冲液：称取25.0g乙酸铵溶于25mL水中，加45mL 6mol／L盐酸，用稀盐酸或稀氨水调节pH值至3.5，用水稀释至100mL；

酚酞指示液：1％乙醇溶液；

饱和硫化氢水：将硫化氢气体通入不含二氧化碳的水中，至饱和为止（此溶液临用前制备）；

铅标准溶液：称取0.1598g高纯铅，溶于10mL 1％中，定量移入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。此溶液1mL相当于1.0mg铅。临用前用水稀释100倍，使成1.0mL相当于10μg铅；

1％：取1mL加水稀释至100mL。

4.5.1.2.2.仪器

50mL纳氏比色管；

所用玻璃仪器需用（10～20）％浸泡24h以上，用自来水反复冲洗，最后用水冲洗干净。

4.5.1.3.过程简述

4.5.1.3.1.样品处理

一般样品可直接按“测定”进行测定，如A管的色度深于C管的色度，应先经样品处理。

4.5.1.3.1.1.干法消解：本法适用于不适合用湿法消解的样品。

称取样品5.0g，置于坩埚中，加入适量硫酸浸润样品，小火炭化后，加2mL和5滴硫酸，小心加热，直到白色烟雾挥尽，移入高温炉中，于550℃灰化完全，冷却后取出，加2mL 6mol／L盐酸湿润残渣，于水浴上慢慢蒸发至干。用1滴浓盐酸湿润残渣，并加10mL水，于水浴上再次加热2min，将溶液移入50mL容量瓶中，如有必要须过滤，用少量水洗涤坩埚和滤器，洗滤液一并移入容量瓶中，混匀，每10mL该溶液相当于1.0g样品。

在样品灰化同时，另取一坩埚，按上述方法做试剂空白试验。

4.5.1.3.2测定

A管：吸取含铅量相当于指定的重金属限量的铅标准溶液（不低于10μg铅）于50mL纳氏比色管中（如样品经处理，须同时吸取与样品液等量的试剂空白液），加水至25mL，混匀，加1滴酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水6mol／L或1mol／L调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。

B管：取一支与A管所配套的纳氏比色管，加入（10～20）mL（或适量）样品液，加水至25mL，混匀，加1滴1％酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水6mol／L或1mol／L调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。

c管：取一支与A、B管所配套的纳氏比色管，加入与B管等量的相同的样品液，再加入与A管等量的铅标准溶液，加水至25mL，混匀，加1滴1％酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水（6mol／L或1mol／L）调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。

向各管中加入10mL新鲜制备的硫化氢饱和液，并加水至50mL刻度，混匀，于暗处放置5min后，在白色背景下观察，B管的色度不得深于A管的色度，C管的色度应与A管的色度相当或深于A管的色度。

4.5.2.第二法

按4.4.2方法操作（但在500～600℃灼烧），加0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后(或取供试品一定量，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5～1.0ml，使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽后，加0.5ml。蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在500～600℃炽灼使完全灰化)，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15m1，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml，微热溶解后，移置纳氏比色管中，加水稀释成25ml；另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml与水l5m1，微热溶解后，移置纳氏比色管中，加标准铅溶液一定量，再用水稀释成25ml；照上述第一法检查，即得。再在两管中分别加硫代乙酰胺试液各2m1，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上向下透视，乙管中显出的颜色与甲管比较，不得更深。

4.6.砷的测定

方法一二乙氨基二硫代甲酸银比色法

4.6.1.原理概要

在碘化钾和氯化亚锡存在下，将样液中的高价砷还原为三价砷，三价砷与锌粒和酸产生的新生态氢作用，生成砷化氢气体，经乙酸铅棉花除去硫化氢干扰后，将溶于三乙醇胺－三氯甲烷中或吡啶中的二乙氨基二硫代甲酸银溶液吸收并作用，生成紫红色络合物，与标准比较定量。

4.6.2.主要试剂与仪器

4.6.2.1.主要试剂

、硫酸、盐酸；

硫酸（1mol/l）溶液：量取28mL浓硫酸，慢慢加入水中，用水稀释到500mL；

氧化镁、三氯甲烷、吡啶、无砷金属锌；

20％氢氧化钠溶液；

15％镁溶液；

15％碘化钾溶液（临用前配制，贮于棕色瓶内）；

40％氯化亚锡溶液：称取20g氯化亚锡（SnCl₂·2H₂O），溶于50mL盐酸中；

乙酸铅棉花：将脱脂棉浸于10％乙酸铅溶液中，2h后取出晾干；

吸收液A：称取0.25g二乙氨基二硫代甲酸银，研碎后用适量三氯甲烷溶解，加入1.0mL三乙醇胺，再用三氯甲烷稀释至100mL。静置后过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内备用；

吸收液B：称取0.50g二乙氨基二硫代甲酸银，研碎后用吡啶溶解，并用吡啶稀释至100mL。静置后过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内备用。

1％酚酞乙醇溶液；

砷标准溶液：称取0.1320g于硫酸干燥器中干燥至恒重的三氧化二砷（As₂O₃）），溶于5mL20％氢氧化钠溶液中。溶解后，加入25ml 1mol/l硫酸，移入1L容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度。此溶液1.00mL相当于0.100mg砷。临用前取1.0mL，加1mL1mol／L硫酸于100mL容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度。此溶液1.0mL相当于1.0μg砷。

4.6.2.2.仪器

分光光度计；

测砷装置（见图1）；

 <