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MM_FS_CNJ_0158 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

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MM_FS_CNJ_0158出口食品 蜡样芽孢杆菌 微生物法

 

MM_FS_CNJ_0158

     出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

 

1.适用范围

    本方法适用于出口食品的检验。

2.培养基和仪器

2.1.培养基

    甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP);

    胰酪胨大豆多粘菌素肉汤;

    酚红葡萄糖肉汤;

    硝酸盐肉汤;

    营养琼脂;

    l-酪氨酸营养琼脂;

    溶菌酶营养肉汤;

    改良V-P培养基;

    动力培养基;

    胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB);

    Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液;

    亚硝酸盐试剂;

    V-P试剂;

    碱性复红染色液。

2.2.仪器

    吸管:容量1.0mL和10.0mL,具0.1mL刻度;

    菌落计数器;

    均质器;

    厌氧培养装置;

    涡动搅拌器;

    L形玻璃棒;

    恒温培养箱:30℃及36±1℃。

3.样品的保存和送检

    待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后,应保存于4 ℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验,应将样品储存在-20℃,检验前再于室温下解冻。

    脱水食品可在常温下送检和储存。

4.样品的制备

4.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。

4.2.加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000~20000r/min均质2min。制成1∶10样品稀释液。

4.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中,充分混匀制成1∶100的稀释液。

4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-6

5.检验步骤

5.1.平板计数法

    取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。

    将平板置于30℃培养24h。

    选取具有15~150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。

蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色,环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型,可继续培养24h再计数。

    计数后,从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面,于30℃培养24h,按第6章进行证实试验。

    根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数,按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例:将检样10-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上,生成的可疑菌落数为25个,取5个进行鉴定,证实为蜡样芽孢杆菌的是4个,则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×104×10=2×106

5.2.最近似值(MPN)法

    适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个/g的食品。

    选用三管法MPN系列。取10-1、10-2、10-3三种稀释液,每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤,每管接种1mL。

    置于30℃培养48±2h。

    从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。

    置30℃培养24~48h。

    从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落,接种营养琼脂斜面,置30℃培养24h,供作证实试验。

    根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数,由MPN表〔附录C(补充件)〕计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g,并作出报告。

6.证实试验

6.1.形态观察

    取营养琼脂斜面培养物,作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌,呈短链或长链,芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不使菌体胀大。

6.2.生化学性状

    葡萄糖发酵试验:

接种于酚红葡萄糖肉汤中,厌氧条件下35 ℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。

    硝酸盐还原试验:

接种于硝酸盐肉汤中,35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。

    V-P试验:

    接种于改良V-P培养基中,35℃培养48h。加V-P试剂及肌酸数粒,静止1h,应为阳性反应(伊红色)。

    L-酪氨酸分解试验:

    接种于L-酪氨酸琼脂培养基上,35 ℃培养48h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72h再观察。

    溶菌酶试验:

    用直径2mm接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,35 ℃培养24h。该菌在本培养基(含0.001%的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养24h。

    卵磷脂酶试验:

    接种于MYP琼脂平板上,35 ℃培养24h。阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)。

6.3.蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验

    动力试验:

    用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30 ℃培养24h。有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长,形成所谓的蜂巢状扩散。也可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运动。

    根状生长试验:

    用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上,30℃培养18~24h。蜡样芽孢杆菌群的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特征。

    溶血试验:

    取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上,30~32 ℃培养24h。蜡样芽孢杆菌落周围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象,而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。

    蛋白质结晶毒素试验:

    取经30 ℃培养24h并于室温放置2~3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,于涂膜加甲醇半分钟后倾掉,再通过火焰干燥,于载片上滴满0.5%碱性复红液,放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min,移去火焰,使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富,应将培养物置室温2~3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性,而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。

    结果解释及报告:

    符合蜡样芽孢杆菌群的特征,有活泼的动力,很强的溶血能力,不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素,可报告为蜡样芽孢杆菌。

对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验。如青霉素酶、噬菌体试验等。

7.来源:

    SN  0176—92

 

 

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