AM-AM-FS-Eu-0001 磺胺二甲基嘧啶- 用GC-MS 测定磺胺二甲基嘧啶（确正法）

AMAMFSEu0001磺胺二甲基嘧啶 GC-MS确正法

AM-AM-FS-Eu-0001

磺胺二甲基嘧啶- 用GC-MS 测定磺胺二甲基嘧啶(确正法)

1.原理概要

    肾脏及肌肉提取物经氨基柱和阳离子柱净化后干燥,用重氮甲烷甲基化, 将甲基化提取物用GC-MS进行分析。

2.主要试剂和仪器

2.1.主要试剂

二甲基亚硝基苯磺酰胺；

氢氧化钾；

二乙醚；

乙基二甘醇；

盐酸；

甲醇；

丙酮；

    磺胺溶液为Ｓigma公司出品．混标中各标准物的浓度均为１mg/ml的甲醇溶液．这些标准是：磺胺二甲基嘧啶；磺胺甲基嘧啶；对氨基苯磺酰胺；磺胺吡啶；磺胺噻唑；磺胺嘧啶；磺胺脒；磺胺氯嗪；磺胺甲氧嗪；磺胺喹噁啉。

2.2.仪器

小型重氮甲烷发生设备；

具特氟龙塞的分液漏斗；

离心管；

水浴；

氮气吹干设备；

GC－MS仪器

3.过程简述

3.1.样品制备

    样品提取后过柱子净化，干燥，混标也同时干燥，最后用１ml甲醇复溶，

称2.5g解冻并绞碎的样品放入30ml离心管中，加6ml 乙酸：丙酮（1:1, v/v），再加12ml乙酸乙酯，均浆１min后，2500rpm离心15min，吸出上清液，重复上一步骤，合并上清液，放入冰盒中至水层完全冻结（至少15min），乙酸乙酯层倒入另一30ml离心管中，进行下一步净化。

用抽真空装置进行柱子预洗，氨基柱用3ml正已烷预洗，阳离子柱先用3ml正已烷再用6ml 乙酸：乙酸乙酯（5:95, v/v）预洗，（阳离子柱不能干），然后将两根柱子一上一下安装好，置于抽真空装置上。

将乙酸乙酯提取液转移到柱子，使其流经安装好的这两个柱子，用6ml　甲醇洗柱子关上真空旋塞，弃去氨基柱，先用6ml水，再用12 ml甲醇洗阳离子柱．

　取下阳离子柱，并与一注射器相连，用3ml氨－甲醇（25:75,v/v）洗脱（用正压），洗出液置于一微量瓶中.

在45～50℃的水浴上用氮气将洗脱液吹干，然后用0.5ml丙酮溶解，并用吸管转移至另一小瓶中,再用0.5ml丙酮清洗，并入小瓶中,如果需要，这个洗脱液可在-20℃冰箱放置过夜。

3.2.衍生化

3.2.1.先配好如下溶液：

将2g 二甲基亚硝基苯磺酰胺溶于20ml二乙醚中。

将3g 氢氧化钾溶于3ml 水中20min，并加入10ml 乙基二甘醇

10%盐酸溶液, 100ml。

3.2.2.按照说明安装小型重氮甲烷装置。

3.2.3.除非是对样品甲基化，否则过程中产生的重氮甲烷必须通入10%盐酸溶液中。

3.2.4.将（2）倒入反应瓶中。

3.2.5.将分液漏斗置于反应瓶上，溶液(1)置于分液漏斗中。

3.2.6.在50～60℃水浴中，加热反应瓶，并小心地使二甲基亚硝基苯磺酰胺溶液缓缓地加入反应瓶中，这个过程大约20min．一旦反应开始，重氮甲烷将通入样品或标准溶液中，直到溶液呈现黄色，立即将重氮甲烷通入10%盐酸溶液中。

3.2.7.一旦所有样品及标准溶液都衍生化完毕，将重氮甲烷通入10%盐酸溶液中直到所有衍生化试剂都用完才停止反应。

3.2.8.将衍生物在N_２下吹干，并用100μl丙酮复溶。

3.3.GC-MS分析

GC参数

柱子：Ｊ＆Ｗ　石英毛细管柱，SE – ,15m×0.25mm,

进针：0.5μl  

进样口温度：260℃

柱箱温度：

起始温度　　终止温度　　升温梯度　　   时间　  　总时间

      (℃)　     (℃)       (℃/min)      (min)       (min)

       210        210           -          2.0         2.0

       210        260           5           -          12.0

       260        260           -          4.0         16.0

载气：　   氦气；　     流速：　   1cm³/min    柱前压：10 psi

用OV-1柱(10 ng)，先进混标(10 ng)，这些标准的出峰时间分别为：

对氨基苯磺酰胺：5.3；磺胺吡啶：8.8；磺胺噻唑：9.0；磺胺嘧啶：9.9；磺胺甲基嘧啶：10.8；磺胺二甲基嘧啶：11.8；磺胺脒 ：12.1；磺胺喹噁啉：15.2 ；磺胺甲氧嗪：15.7；磺胺氯嗪：19.7；

MS参数

离子源：EI；　

离子源温度：150℃；

管线温度：90±5℃；

电子放大器：1.4KV；

电子轰击源：70eV；

其它参数根据仪器而定；

用EI源在m/z=50和500之间扫描；

分析混标（10μg/100μl），与已知的峰相比确定每一标准峰，用GC进行样品预分离，并用保留时间确定各组分；

分析基它混标及样品，标准先分析低浓度再分析高浓度，每两针之间要进一针正己烷；

4.结果分析

4.1.如果GC－MS数据满足下列条件，则可认为结果可信：

4.2.样品峰与GC中标准品的峰一致.

4.3.GC中样品峰在MS中的离子碎片与MS中标准品的离子碎片一致.

两离子间的比例须与标准一致.

5.检测限

100μg /Kg．

6.来源:

欧盟食品分析方法CY3.1