微生物学实验复习汇总

微生物学实验复习汇总

1.细菌培养基的配制过程？ 答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面（搁置斜面的长度不超过试管总长的1/2）

2.空的玻璃器皿一般用 干热灭菌 ，若用湿热灭菌。则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。

3.接种环在用前必须烧灼灭菌，用后也应立即烧灼。 4、培养基的种类及用途： 标准 培养基类型 配制特点 主要应用 固体培养基 加入琼脂较多 物理性质 半固体培养加入琼脂较少 基 液体培养基 不加入琼脂 菌种分离、鉴定、计数 菌种保存 工业生产、连续培养 合成培养基 由已知成分配制而成，培养基成分明确 分类、鉴定 化学合成 天然培养基 由天然成分配制而成，培养基成分不明工业生产 确 半合成培养兼有天然培养基和合成培部分天然物质和部分化学试剂配制而成 基 养基的优点 加富培养基 营养物质仅适合一种或一类微生物 目的用途 鉴别培养基 添加某种指示剂或化学药剂 选择培养基 添加(或缺少)某种化学成分 5、培养基中的营养物质： 营养要素 含义 作用 能使某种微生物的生长、繁殖比其他微生物更加迅速、逐渐淘汰其他微生物 菌种的鉴别 菌种的分离 主要来源 碳源 构成生物体细胞的物质和一无机化合物：CO2、NaHCO3； 凡能提供所需碳元些代谢产物，有些是异养生物有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼粉、素的物质 的能源物质 石油等 凡能提供所需氮元合成蛋白质、核酸以及含氮的无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；素的物质 代谢产物 有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 生长必不可少的微酶和核酸的组成成分 量有机物 维生素、氨基酸、碱基等 氮源 生长因子 水 不仅是优良的溶剂，而且可维在生物体内含量很持生物大分子结构的稳定 高，在低等生物体 内含量更高 为微生物提供除细胞内的组成成分，生理调节碳、氮元素以外的物质，某些化能自养菌的能各种重要元素，包源，酶的激活剂 括某些大量元素 无机盐

6、灭菌与消毒： 项目 概念 常用方法 应用的范围 使用较为 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min 一般物品 温和的物巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃一些不耐高温的液体，如牛奶 理 煮15 min 或化学方如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水法 化学药剂消毒法 源等 仅杀死物体 消毒 上绝大多数 微生物(包接种室 括病原微紫外线消毒法：30 W紫外灯照射30 min 生物和有害微生物的营养细胞) 使用强烈 灼烧灭菌：酒精灯火焰 接种工具的灭菌 的物理或 干热灭菌：160～170 ℃下灭菌1～2 h 玻璃器皿、金属工具的灭菌 化学方法 使物体内 灭菌 外所有的 微生物永 高压蒸汽灭菌：121 ℃条件下，灭菌15～30 培养基及容器灭菌 远丧失其 min 生长繁殖 能力 7.酵母的死细胞和活细胞可通过哪些方式鉴别？ 答：、用美蓝液对酵母菌染色后，活细胞为无色，死细胞为蓝色 、平板菌落计数法

8、实验常用的凝固剂是哪一种？固体培养基、半固体培养基及液体培养基加凝固剂琼脂的量为多少？琼脂在什么温度下溶化？什么温度下凝固？

答：常用凝固剂是琼脂，分别为1—2%，0.5% 96°C下融化，40°C凝固

9.配制培养基时应遵循哪些原则？配制培养基的一般方法和步骤是什么？配制培养基时不可用铜锅或铁锅，原因是什么？答：原则：目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约 。 铜或铁锅成份会对培养基成份造成干扰。

10、培养基分装时，液体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？固体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？半固体分装高度以试管的多少为宜？

答：液体：试管高度的1\\4,三角瓶的试管高度的1\\2,固体：试管高度的1\\5，三角瓶的1\\2，半固体：试管高度的1\\3。高度不适宜易造成搁置斜面时污染棉塞及瓶口。

11.培养基灭菌时外用牛皮纸包扎的目的是什么？ 答：防止灭菌时冷凝水润湿棉塞

12.摆斜面的正确方法是什么？

答：试管口搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

13.棉塞的作用是什么？正确的棉塞要求是什么？棉塞的长度多少在管口外，多少在管内为宜？作棉塞的棉花要求是什么？能否用脱脂棉？为什么？ 答：作用：阻止外界微生物进入培养基内造成污染和能通气。

14.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如果来不及灭菌应如何处理？

答：很明显，培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。如果不立即灭菌，那么，就会长菌。

15.采用什么方法能分离到能分解并利用苯作为碳源和能源物质的细菌纯培养？（以苯作为唯一碳源的选择培养基）

答：①从苯含量较高的环境中采集土样或水样；②配制培养基，倒平板，一般仅以苯作为唯一碳源（A），另一种不含任何碳源作为对照（B）；③将样品适当稀释（十倍稀释法），涂布A平板；④将平板置于温度适当的条件下（37℃）培养，观察是否有菌落产生；⑤将A平板上的菌落编号并分别转接至B平板，置于相同温度条件下培养（在B平板上生长的菌落可利用空气中的CO2的自养型微生物）；⑥挑取在A平板上生长而不在B平板上生长的菌落，在一个新的A平板上划线、培养，获得单菌落，初步确定为可利用苯作为碳源和能源的微生物纯培养物；⑦将初步确定的目标菌株转接至以苯作为唯一碳源的液体培养基中进行摇瓶发酵实验，利用相应的化学分析方法定量分析该菌株分解苯的情况。

16.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？

答：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。

17.在干热灭菌过程中应注意哪些问题,为什么？

答：1 干热过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。电热干燥箱具有可以观察的窗口，灭菌过程中玻璃温度较高，注意避免烫伤。 2 电热干燥箱内温度未降到70°C以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 3 物品不要摆的太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。

18.高压蒸汽灭菌的关键技术是什么？（使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅的压力(100 kPa)、温度(121 ℃)和灭菌时间(20 min)。

19.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

答： 灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀。否则就会因为锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至烫伤操作者。

20.对含糖（如葡萄糖或乳糖等）培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用大多压力、多长时间灭菌为宜？

答100KPa,121°C，15~30min

21.对血清、噬菌体浓缩液、氨基酸溶液、维生素溶液、抗生素溶液能否进行高压蒸汽灭菌？应采用何种方法除菌为宜？

答：不能，采用微孔滤膜过滤除菌法为宜。

22.紫外线灭菌的原理及适用对象是什么？

答：原理：紫外线波长在200nm~300nm具有杀菌作用，其中265~266nm杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌。

适用对象：无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。

23.过滤除菌法的适用对象是什么？缺点是什么？

答：只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌，缺点是虑量有限。

24.微生物分离纯化常用的方法有哪些？

答：划线法、稀释平板法、选择培养基法、单细胞挑取法。

25.如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为该如何做？ 答：在培养基中加入少量青霉素（选择培养基）

26.稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入到装有菌液的皿内？为什么需要使试管口通过火焰？（通过灼烧灭菌，防止试管口的微生物污染培养基）

答：如果高于50℃会将菌体烫死，低于40℃培养基会凝固，不能倒平板。可以用手触摸盛有培养基的试管，感觉试管的温度下降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了

27.在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置？

答：①防止培养基水分蒸发②防止冷凝水的流动造成平板表面的“交叉感染”，影响单个菌落的形成③防止外物掉在培养基上。

28.常用于测定微生物数量的方法有哪些？

答：1 个体计数法：直接法：血球计数板法、涂片染色法；间接法：平板菌落数法，薄膜过滤计数法。

29.什么是显微直接计数法？工具是什么？此方法的优缺点？缺点怎样克服？ 答：指用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。工具：血细胞计数板、显微镜 优点：直观、快速、操作简单 缺点：所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的活菌进行计数 克服方法：综合活菌染色、微室培养以及加细胞分裂抑制剂等只计数活菌体。

30利用血球计数板计数时，如何计数？计算公式？

答：以25个中方格的计数板为例，设5个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1ml菌液中的总菌数=(A\\5)*25*

104×B

31.影响微生物生长的主要因素有 营养物质、 水的活度 、 温度 、_pH__和 氧 等。 32.细菌、酵母菌、霉菌、真菌放线菌培养的最适宜PH一般为多少?

答：细菌最适PH6.5～7.5、最适温度37℃左右；酵母菌最适PH6.0～6.5、发酵最适温度18～ 25℃左右；毛霉最适PH4.5～5.5、发酵最适温度16℃左右；（真菌最适PH5.0～

6.0，放线菌最适PH7.5～8.5）。 33.无菌操作和接种技术 (1)接种

概念：在_无 菌 条件下将微生物接入 培养基____的操作过程。 工具：玻璃刮铲、接种针和接种环。

方法：穿刺接种、斜面划线接种和平板划线接种、涂抹平板等。 （2）无菌操作——微生物接种技术的关键

①培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要 灭菌_。 ②通常接种操作要在____酒精灯火焰__的附近进行。

【想一想】 在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作？ 提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。 34、微生物的分离

（1）原理：根据微生物对_营养成分、氧气、pH等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到 选择分离 微生物的目的。 (2)方法

①据菌落形态特征初步分离 ②常用方法——平板分离法

混合平板法

平板划线法 ：是常用的平板分离法， 分类______________

有扇形划线、 连续划线、交叉划线和方格划线等

目的：在培养基上得到目的微生物的 单个 菌落 【归纳】无菌技术的具体内容

(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

(3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 (4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。

（5）在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。

35、平板分离法

①原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落。

②常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。

③.方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生长。

(2)混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化的琼

脂混合，将与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。

(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。

4.目的：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目的微生物的单个菌落。 (1)灭菌后的接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。 (2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。 (3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。（细胞接种于裂口内，生长空间变小，影响生长。.菌体在狭缝中生长时，氧气可能不足，是其生长减缓。 在划破的培养基下会因培养基的沟槽造成菌落形态改变。不能形成正常的特征形态，

涂抹平板法 _____________

影响对菌落形态的观察及特征鉴别，同时菌落生长中，凹陷处积累代谢废物，抑制细菌生长。）

36、菌落数目的统计方法 (1)显微镜直接计数法

①原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻 片，其上有特定的面积为1 mm2，高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中

格，每个中格再被划分成16个(或25个)小格，每个计数室都由400个小格组成。 ③操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

④计算公式

每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。 ⑤缺点：不能区分死菌与活菌。

（2）间接计数法(活菌计数法)

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 ②操作

⒈设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落 数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培

养，计算出菌落平均数。

2.为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。 (3)滤膜法

①实例：测定饮用水中大肠杆菌的数目。

大肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿色的菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。 【特别提醒】

统计菌落数目的注意事项：

①一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。 ②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。 ③统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。 ④设置对照，目的是排除实验组中无关因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

37、实验探究：微生物的分离 【操作与实践】

微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。 1.稀释

用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL无菌水的大试管中，

充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，依次类推制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。

2.划线或涂布

(1)平板划线分离法——在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种(如图)。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。

特别提醒

平板划线法中的注意事项

① 取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧

接种环，每次灼烧目的 如下表： 取菌种之前 每次划线之前 划线结束 杀死上次划线后接种环上残留的菌杀死接种环上种，使下次划线的菌种直接来源于上杀死接种环上残存的菌种，避免细目的 原有的微生物 次划线的末端，使每次划线后菌种数菌污染环境和感染操作者 目减少

②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

(2)涂布分离法——取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5和10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌液吸附进培养基(如图)。

特别提醒

①将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。

②操作中一定要注意防火，不要将过热的玻璃刮铲放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 3.培养

将划线或涂布接种的平板倒置于37 ℃培养箱 中，培养16～24 h，即可长出单菌落。 【问题与探究】

1.在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？ 【提示】 (1)酒精灯与培养皿的距离要适中。 (2)接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。 (3)接种环要用酒精灯灼烧。

(4)将沾有少量酒精的玻璃刮铲在火焰上引燃。 2.未接种的培养基表面有菌落生长，说明了什么？

【提示】 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要重新制备。

3.在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立菌落？

【提示】 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上出现其他菌落，有其他杂菌混杂，可再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。