湖北师范学院
生命科学学院 编著 微生物课程组
2008 年 3 月
前 言
近几年来，随着微生物学科的迅猛发展，教学内容更新较快。 微生物被作为主干基础课列入了高等院校生命科学各专业的 教学 计划中，并且实验课单独作为一门课程开出。为了提高教学水平， 反映出本学科更具科学性、先进性和实用性的实验内容，根据教学 大纲的要求和课程设置，同时根据本校教学实验条件，在参阅中外 相关文献，学习兄弟院校的教学经验和资料的基础上，编写了本实 验讲义。
本书为本校生命科学学院相关专业微生物实验指导书，同时可 作为其他相关专业学生参考。
本书由湖北师范学院生命科学学院微生物学课程组编写。本书 分五个部分，基础性实验由冯艳丽、胡远亮、石鹤、余翔老师完成， 综合性实验由石鹤、董昌金、余翔老师完成，实验基本操作和附录 等胡远亮老师完成，最后由石鹤和胡远亮老师统稿。涂俊铭、李京 京老师参与了本书部分内容的编写， 书中引用了其他作者部分内容， 在此致以诚挚的谢意。
编者
2008.3
II
微生物实验守则
一、微生物实验课的目的和要求
微生物学实验是生物专业学生的实验类专业必修课，通过本课程的教 学可使学生完整、全面的了解和掌握微生物学的基本理论和研究方法，使 学生得到有关微生物实验技能的基本训练，进一步加深对微生物基础理论 的理解，并力求达到系统地培养学生分析问题、解决问题的能力和实际动 手能力，在实验中进一步提高学生的科学素质修养。
实验教学的要求包括以下几个方面：基本实验操作技术要求学生掌握 显微镜的使用、生物染色技术、形态学观察的方法、无菌操作计数、培养 基的配置和灭菌方法、微生物分离、纯化等；在实验仪器方面要求学生对 微生物实验室常用的仪器设备的基本原理、构造、使用方法及使用中的注 意事项有基本了解；实验过程要求学生仔细观察实验现象，完整记录原始 实验数据、结果，分析实验现象并认真填写实验报告，实验报告内容主要 包括实验目的和原理、实验步骤、实验结果和分析与讨论等。 二、实验的进行程序和要求
1．预习 学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实 验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2．讲解 教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时 间按实验指导的要求进行独立操作与观察。
3．独立操作与观察 除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作 和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。 4．示教 每次的实验都备有示教内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的 难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。
5．作业 实验报告必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验 结束时呈交。学生应认真阅读教师批改后的实验报告，不断提高实验质 量。
III
6．小结 实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的 问题。
三、实验规则和注意事项
1．每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验 原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。
2．上实验课时必须携带实验指导、实验报告纸及绘图文具等，按规定座位 入座。
3．实验前，要认真检查所用仪器、药品是否完好、齐备，如有缺损应及时 向教师报告，自己不得随意调换标本、仪器等。没有得到教师的允许， 不能动用实验室其它非本次实验所用的仪器设备。
4．实验时要遵守纪律。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧哗，不准在实 验室吃食和会客。
5．实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进 行。使用显微镜检查非永久片时，要特别小心。防止染料或试剂沾污镜 头和镜台，不要用高级显微镜观察非永久片。操作要正规，观察要认真 仔细，及时完成实验报告。
6．要爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有 损坏器材应立即报告，并主动登记、说明情况。凡是有化学药品的试剂 和溶液瓶上，必须贴上标签，注明名称、成份、浓度、配制日期。 7．实验结束后，应清理实验台面，所有液体废物、酸类、染料等，应倒在 废物缸内，不能倒在水槽中。认真清理好仪器、药品及其他用品，放回 原处。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、 门窗后再离开。
8．爱护实验用品，凡损坏的玻璃等器具，应做好详细记录，人为因素损坏 的，应按规定赔偿。
IV
目 录
前 言...........................................................................................................................................II 微生物实验守则.........................................................................................................................III 目 录.......................................................................................................................................5 Ⅰ 微生物学实验基本操作技术.................................................................................................1
一、棉塞的制作...................................................................................................................1 二、玻璃器皿的清洗...........................................................................................................2 三、玻璃器皿的包装...........................................................................................................2 四、灭菌设备操作技术.......................................................................................................3 五、斜面培养基制备及倒平板技术...................................................................................4 六、接种技术.......................................................................................................................4 七、光学显微镜油镜的使用...............................................................................................8 八、写标签...........................................................................................................................8 Ⅱ 基础性实验.............................................................................................................................9
实验一 玻璃器皿的包扎及灭菌.......................................................................................9 实验二 实验室环境和人体表面微生物的检查................................................................13 实验三 培养基的配制.....................................................................................................15 实验四 微生物形态特征的观察.....................................................................................18
第一部分 微生物菌落特征的观察..........................................................................18 第二部分 细菌的单染色法及形态观察..................................................................19 第三部分 放线菌的形态观察.................................................................................21 第四部分 酵母菌的形态观察.................................................................................23 第五部分 霉菌的形态观察.....................................................................................24 实验五 细菌革兰氏染色法.............................................................................................26 实验六 微生物大小及数量测定.....................................................................................30
第一部分 微生物大小的测定.................................................................................30 第二部分 显微镜直接计数法测定微生物数量......................................................33 实验七 噬菌体特异性溶菌试验...................................................................................36 实验八 微生物液体深层培养—发酵罐的使用..............................................................38 实验九 食品中大肠菌群的测定.....................................................................................41 Ⅲ 综合性实验...........................................................................................................................45
实验十 苯酚生物降解菌的筛选.....................................................................................45 实验十一 乳酸菌的分离与鉴定.....................................................................................49 实验十二 紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应..........................................53 实验十三 柠檬酸液体深层发酵和提取.......................................................................55 Ⅴ 附 录.....................................................................................................................................60
附录 1 实验室意外事故的处理......................................................................................60 附录 2 常见培养基的配制..............................................................................................61 附录 3 实验用染色液及试剂的配制..............................................................................66
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Ⅰ 微生物学实验基本操作技术
一、棉塞的制作
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对 实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口（或三角瓶口）完 全适合，过紧防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的（棉塞制作过程图 1）。 塞上棉塞时，应使棉塞长度的 1/3 在试管口外，2/3 在试管口内。做棉塞的棉花要选纤维较 长的，一般不用脱脂棉做棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格昂贵。
图 1 棉塞制作过程
此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞，即用几层纱布（一般8 层）相互 重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基 的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体的生 长或发酵，通气塞的形状如图2。
A. 配制时纱布塞法； B. 灭菌时包牛皮纸； C. 培养时纱布翻出
图 2 通气塞
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二、玻璃器皿的清洗
1. 不能用有腐蚀性的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新 的玻璃器皿应用 2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。
2. 用过的器皿应立即洗涤。
3. 强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废 液缸内。
4. 含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然 后再用洗洁净清洗。凡遇有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。
5. 一般的器皿可以用去污粉、肥皂或洗洁净清洗，油脂很重的器皿应先将油脂擦去。 沾有煤膏、焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或 40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或有 油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、汽油、丙酮等）揩去。
6. 载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡 2 小时，用清 水冲净，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于95%酒精中保存备用。
7. 洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。
三、玻璃器皿的包装
1. 培养皿的包装
培养皿常用旧报纸紧紧包裹，一包 7～10套，包 好后干热或湿热灭菌。 如果将培养皿放入金属筒内进 行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒形的带 盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图 3），此 框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。
2. 移液管的包装
准备好干燥的移液管， 在距其粗头顶端约 0.5 cm 处，塞约 1.5 cm 长的棉花，以免使用时将杂菌吹入
A. 内部框架 B. 带盖外筒 图 3 装培养皿的金属筒
其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气 时棉花会下滑），接着按图 4 方法包扎，后将移液管集中在一起，用一张大报纸包好，进 行干热或湿热灭菌。
图 4 移液管的包扎方法与步骤
2
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3. 试管和三角瓶的包装
试管管口和三角瓶瓶口塞上棉花塞或硅胶塞后，在棉 花塞与管口和瓶口的外面用二层报纸包扎好（如有牛皮纸， 效果更好），进行干热或湿热灭菌。试管较多时，一般 7 个 或 10 个一组，再用双层报纸包扎。
四、灭菌设备操作技术
1. 上海申安 LDZX50KBS 灭菌锅的使用
1） 打开电源与开关，检查水位显示灯，视水位显示灯 状况，不加或添加适量水（高水位：不必加水；低水位： 视情况而定；缺水：必加水；无显示：视情况而定）。
图 5 LDZX50KBS 灭菌锅
2） 加灭菌物品（注意：物品不能过于密集，否则会影响灭菌效果）。
3） 将锅盖旋到灭菌锅正上方密封处（注意：锅盖用手提着缓慢旋至正上方，不要触 及密封圈，造成密封圈破损，也不要将锅盖旋得太高，否则锅盖无法归位至正上方）。
4） 按待灭菌物品的要求，设定温度和时间。
5） 进入工作状态后，查看排气（水）阀，将阀门旋至排气处。
6） 待有大量白色蒸汽产生时，关闭排气阀，关闭后温度持续上升（注意：在使用高 压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要）。
7） 灭菌结束，压力降至“0”时，打开排气阀，气体排尽后，开盖取物。（注意：压力 一定要降到\"0\"时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内 的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染， 甚至灼伤操作者） 。
2. BCM1300A超净工作台的使用 1） 依次打开电源开关及工作开关，紫外 灯照射 20 min，开启鼓风机运转10 min，方可 进行实验操作。
2） 将紫外灯切换到照明灯（鼓风机保持 运转），打开玻璃门（玻璃门开启幅度不能过 高，以不超过下巴为宜），手臂进入操作台前 先点燃酒精灯， 再用 75%的酒精棉球擦净工作 面，并对手进行消毒。
3） 操作时，应在工作台中央无菌区域进行（尽 量不要讲话）。
4） 操作完毕后熄灭酒精灯，清理工作台。离开 前， 关闭工作台工作开关及电源开关， 将所有物品归 位，并带走废弃物。
图 7 摆斜面
图 6 LDZX50KBS 灭菌锅及控制面板
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五、斜面培养基制备及倒平板技术
1. 搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至 55℃左右（以防斜面冷凝水太多），将试管口端搁在移液管 或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 1/2 为宜（图 7）。
2. 倒平板
培养基冷至 55℃左右时，右手持装有培养基的三角瓶，用左手将瓶塞取出，瓶口对着 火焰。左手持培养皿将皿盖在火焰旁打开一缝，迅速倒入培养基约 15 mL（图 8），加盖， 轻轻晃动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，冷凝后即为平板。
图 8 倒平板
六、接种技术
1. 用接种环转接菌种
1） 接种环灭菌 左手持斜面培养物，右手持接种环，按图 9 方法将接种环进行火焰 灼烧灭菌（烧至发红），然后在火焰旁边打开斜面培养物的试管塞（注意：塞子不能放在 桌上），并将管口在火焰上烧一下（图 10B）。
2） 取培养物 在火焰旁，将接种环轻轻插入试管的上半部（此时不要接触斜面培养 物），至少冷却 5 s后，挑取少许培养物（菌苔），再烧一下管口，加塞并将其置于试管架 中（图 10C，D，E）。
图 9 接种环（针）的火焰灭菌步骤
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图 10 用接种环转接菌种的操作程序
3）接种 用左手迅速从试管架上取出一支未接种的斜面培养基， 在火焰旁取下塞子， 管口灼烧一下，将沾有少量菌苔的接种环迅速放处试管的底部（注意：接种环不要碰到试 管口边）并从下到上划一直线，然后再从其底部开始向上作波浪形划线接种（图 10F）。完 毕后，同样烧一下试管口，加塞（图 10G），将接种环在火焰上灼烧后放回原处（图 10H）。 如果是向盛有液体培养基的试管和三角瓶中接种，则应将挑有菌苔的接种环首先在液体表 面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。
上述无菌操作技术也可按图 11 的方式，将待接和被接的 2 支试管同时拿在左手上进 行。
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图 11 手持 2 支试管的接种方式
2. 用移液管转接菌液
轻轻晃动装菌液的试管（注意：不要溅到管口），暂放加试管架上。取一支已灭菌的 移液管，按图 12 取一定量的菌液，迅速转入另一支装有培养液或无菌水的试管中。
图 12 用移液管吸取菌液
图 13 平板划线
3. 平板划线技术
按无菌操作（参考图 11），用接种环取菌悬液或菌苔。在近火焰处，左手拿皿底，右 手拿接种环（图 13），划线，方法如下（划线的方法有很多，但无论采用哪种方法，其目 的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，培养后能形成单菌落）：
方法一：用接种环先在平板的一边作第一次平行或线3～4 次，再转动平板约 70 度，
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并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线（这样第二次 划线是在第一次基础上稀释的），再用同样的方法划 1～2 次（图 13A）。划线完毕后，盖 上皿盖，倒置于培养箱中培养。
方法二：直接连续密集划线，划线完毕后，盖上皿盖，倒置于培养箱中培养（图 13B）。 4. 土壤样品的梯度稀释涂平板技术
1） 取土样 取表层以下 5 cm～10 cm处的土壤，放入取样袋中，置于 4℃冰箱中暂 存。
2） 土样处理 取土样10 g，迅速倒入带玻璃珠的 90mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以 充满瓶底力最好） ，振荡 15 min～25 min，使土样充分打散。
3） 梯度稀释 用 1 ml 的无菌移液管，从中吸取 1 ml 的土壤悬液加入盛有 9 ml 无菌 水的试管中，充分混匀，然后用无菌移液管从此试管中吸取 1 ml 加入另一盛有 9 ml 无菌
1 2. 3 4 5 水的试管中，混合均匀，以此类推制成10 、10 、10 、10 、10 等不同梯度的土壤溶液
（图 14A）。
图 14 土壤梯度稀释操作过程
注意： 严格的条件下， 操作时移液管尖不能接触液面， 每一个稀释度换用一支移液管， 每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减 少稀释中的误差。
6. 5.
4）涂布 取平板， 皿底分别用记号笔写上稀释度， 然后用无菌移液管分别从 10 10 4
10 三管土壤稀释液中各吸取 0.1 ml 对号放入已写好稀释度的平板中（从低浓度到高浓度
依次取，不用换移液管），用无菌玻璃涂布棒按图 15，在培养基表面轻轻涂布均匀，室温 下静置 5 min～10 min，使菌液吸附进培养基。
图 15 平板涂布操作图
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平板涂布方法：将 0.1ml 菌悬液小心滴在平板培养基表面中央位置（为使0.1 ml 的菌 液要全部滴在培养基上， 将移液管倾斜， 尖端轻轻接触培养基表面， 液体会自然全部流下）。 右手拿无菌涂布棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使 之分布均匀，然后改变方向沿一垂直线来中推动，平板内的边缘处可改变方向用涂布棒再 涂几次。
七、光学显微镜油镜的使用
1. 标本放在载物台上，用压片夹固定。
2. 低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油 镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几 乎接触玻片时停止转动。
3. 眼睛移至目镜，缓慢转动微调节器（只能朝远离物镜头的方向调节，以免压碎标本 和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。
4. 观察完毕，取下装片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的香柏油。若油已 较干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上，擦净，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
5. 使用完毕后，填上使用记录，并将显微镜旋转妥当。 附：油镜提高分辨率原理
油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间是隔一层油质。如香柏油的折射率 n=1.52，与玻璃相同。（1）光线通过不减低视野的照明度；（2）更主要能增加数值孔径， 提高显微镜的放大效能。
分辨率=λ/2NA
（物镜的数值孔径值）NA=n×sinα
λ=光波波长 α=镜口角的半数
可知 n（介质折射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作用。
八、写标签
任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（最好用记号笔的小 头书写，字尽量小些，易清洗），记好班级、姓名、日期、材料名称等必要信息。
注意：培养皿的记号一般写在皿盖上，易于观察，也不易与其它皿盖相混淆。
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Ⅱ 基础性实验
实验一 玻璃器皿的包扎及灭菌
【课前预习】
1. 高压蒸汽灭菌原理；
2. 上海申安 LDZX50KBS 灭菌锅的使用方法。
【目的要求】
1. 学习并掌握玻璃器皿的包扎方法；
2. 掌握高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
【基本原理】
微生物学实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌，才能用来培养微生物。玻璃器 皿的包装方法正确合理，在使用过程中才能有效防止杂菌的污染。玻璃器皿包装好后，一 般用高压蒸气灭菌法进行灭菌。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅 隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭 排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高， 得到高于 100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
【实验用品】
棉花， 试管， 培养皿， 纱布， 三角瓶， 橡皮筋， 量筒， 牛皮纸 （或旧报纸） ，LDZX50KBS 立式高压蒸气灭菌锅等。
【方法步骤】
1. 清洗试管、三角瓶，培养皿等玻璃器具，烘干（事先熟悉实验室的结构与功能） 。 2. 制作试管棉塞及三角瓶棉塞（参照微生物学实验基本操作技术） 。 3. 用量筒或吸管取适量自来水于三角瓶和试管中，包装好以制备无菌水。 4. 包装空培养皿，移液管。
5. 灭菌（参照微生物学实验基本操作技术）。
【实验结果】
记录自己制作的实验用品（含无菌水）的名称、规格与数量。
【注意事项】
1. 实验前，熟悉实验室布局，了解实验仪器用品摆放规律及用途；
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2. 制备无菌水时，试管装水量要超过试管高度的 1/5，三角瓶装水量不要超过规格容量的
1/2（装量过多，灭菌过程中易喷出或润湿棉塞）； 3. 灭菌锅的操作安全。
【实验报告】
1. 高压蒸气灭菌开始之前， 为什么要将锅内冷空气排尽灭菌完毕后， 为什么待压力降低 “0”
时才能打开排气阀，开盖取物。
2. 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素。 3. 灭菌在微生物实验操作中有何重要意义。 附：
消毒与灭菌
消毒与灭菌的两者的意义不同。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而 言，灭菌是指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。在微生物实验中，需要进行纯培养， 不能有任何杂菌污染，因此对所有器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。 消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、 照射和使用化学药品等方法。
1. 干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白 质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质 凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时， 当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越 快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热 灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160℃～170 ℃） ，时间要长（1 h～2 h） ，但干热灭菌温度不能 超过 180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，
甚至引起燃烧。干热灭菌一般使用电热鼓风干燥箱（图 11）。
图 11 电热干燥箱外观和结构
2. 高压蒸汽灭菌
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水 分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干 热大， 三是湿热的蒸气有潜热存在。1g 水在 100℃时， 由气态变为液态时可放出 2.26kJ （千 焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨 胀压大于水蒸气的膨胀压，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低
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于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表 11）。
表 11 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
Mpa
0.03 0.07 0.10 0.14 0.17 0.21
压力数 全部空气排 2/3空气排 1/2空气排 1/3空气排 空气全不排
2 2 出时的温度/℃ 出时的温度/℃ 出时的温度/℃ 出时的温度/℃ 出时的温度/℃ Kg/cm Ib/in
0.35 5 108.8 100 94 90 72 0.70 10 115.6 109 105 100 90 1.05 15 121.3 115 112 109 100 1.40 20 126.2 121 118 115 109 1.75 25 130.0 126 124 121 115 2.10 30 134.6 130 128 126 121
2 注：现在法定压力单位己不用磅和 kg/cm 表示，而是用 Pa 或 bar 表示，其换算关系为： 2
1kg/cm =98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa。
2 2
一般培养基用 0.1Mpa（相当于 15 Ib/in 或 1.05kg/cm ），121.5℃，15～30min 可达到
彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改
2 2
变。例如含糖培养基用 0.06Mpa（8Ib/in 或 0.59kg/cm ）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手
续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 0.1Mpa，121.5℃灭菌 20min 即可，而 盛于大瓶内的培养基最好以 0.1Mpa，122℃灭菌30min。（实验中常用的非自控高压蒸气灭 菌锅有卧式（图 12）和手提式（图13）二种）。
A. 工作原理示意图 B. 灭菌锅外形
图 12 卧式灭菌锅
3. 紫外线灭菌
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的 . 波长为 200~300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以 260nm 的 杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率 与强度和时间的乘积成正比。 紫外线杀菌机理主要是因 为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联， 从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空
图 13 手提式灭菌锅
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气中的氧电离成[O]， 再使 O2 氧化生成臭氧 （O3） 或使水 （H2O） 氧化生成过氧化氢 （H2O2） 。 O3 和 H2O2 均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室 内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过 1.2m为宜。
此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前;可在无菌室内（或接种箱内）喷 洒 3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死 一部分细菌。无菌室内的桌面，凳子可用 2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射， 即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。
4. 过滤除菌
过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的 滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器（图 14）是由上下二个分别具有出口和入口连接装置 的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒 之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面， 从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最 大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实 验室中小量溶液的过滤除菌。
图 14 微孔滤膜过滤器装置
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实验二 实验室环境和人体表面微生物的检查
【课前预习】
1. 微生物的五大共性； 2. 细菌、霉菌的菌落特征； 3. 微生物的接种方法。
【目的要求】
1. 证明实验室环境与体表存在大量微生物； 2. 体会无菌操作的重要性。
【基本原理】
平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种到培养基 上，适温培养，如果有微生物存在，则 12 天内会形成肉眼可见的菌落，而且与样品中的 微生物种类和数量有直接关系。因此，可通过平板培养来检查不同来源的样品中微生物的 数量和类型，初步观察各类微生物的菌落特征。
【实验用品】
1. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基平板。
2. 仪器 恒温培养箱，无菌操作台，高压蒸汽灭菌器。
3. 其它用品 无菌水，灭菌棉签，接种环，酒精灯，试管架，记号笔。
【方法步骤】
1 写标签：班级、姓名、日期、样品来源，用记号笔写于皿底； 2 取样、接种：
1）空气：在实验室工作台上打开培养基平板皿盖，接触空气十分钟，盖好皿盖； 2）实验台面：从试管中取出灭菌棉签，在无菌水中润湿，于实验室工作台上涂擦，
2
范围约 4cm ，然后用棉签在培养基平板上划线；
3）手指：用自己的右手食指在培养基平板上不同区域轻轻接触三到四次； 4）头发：取自己的头发一根，在培养基平板上紧密接触三到四次； 5）咳嗽：打开培养基平板皿盖，正对平板咳嗽三次，距离在 20 cm左右；
6）鼻腔：从试管中取出灭菌棉签，在无菌水中润湿，然后接触自己的鼻腔，用棉签
在培养基平板上划线； 以上步骤均按无菌操作的要求进行。 3 培养：37℃培养箱，皿底向上，培养 12 天。 4 观察：对培养好的平板分别进行观察并纪录。
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【实验结果】
1.菌落计数：统计各平板的菌落数；
2.观察不同的菌落类型：大小、颜色、形态、高度、干湿情况、透明程度、边缘。
【注意事项】
1. 接种过程要注意样品与培养基的接触，不要因为未接触上而出现空平板。 2. 样品与培养基的接触不要过重，以免造成平板破损。
3. 接种过程必须按无菌操作的要求进行，以保证实验结果的可信度。
【实验报告】
1 结果：
表 1 菌落计数结果 样品 菌落数
表 2 个类型菌落的特征
菌落特征 大小 菌落类型
1 2 3 4
颜色
形态
高度
干湿情况
透明程度
边缘
空气
实验台面 手指
头发
咳嗽
鼻腔
2 思考题：
1）无菌操作和接种过程应注意那些问题？
2）实验室环境和人体表面主要存在那些类群的微生物？
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实验三 培养基的配制
【课前预习】
1. 培养基的分类及营养要求； 2. 斜面培养基制备及倒平板技术； 3. 超净工作台的使用。
【目的要求】
1. 掌握培养基的配制原理；
2. 通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
【基本原理】
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分 离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、能源、 无机盐、生长因素和水。本实验通过配制适用于一般细菌、放线菌和真菌的三种培养基来 了解和掌握配制培养基的基本原理和方法。
培养细菌一般用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用十分广泛的天然培养基，其中的 牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而 NaCl 则 提供无机盐。高氏Ⅰ号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，此合成培 养基的含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀，因此，在 混合各成分时，一般按配方要求的顺序依次溶解各成分；此外，合成培养基有的还要补充 微量元素，如高氏Ⅰ号培养基中的 FeSO4∙7H2O 的用量仅为 0.001%，在制备培养基时需预 先配成高浓度的微量元素贮备液，然后再按一定的量加到培养基中。查氏培养基是用来分 离和培养霉菌的合成培养基；麦氏培养基是用来分离和培养酵母菌的半合成培养基。
培养基各成分添加完成后，用稀酸或稀碱将其 pH 值调至所需酸碱度或自然 pH，在配 制固体培养基时，还要加入一定量的琼脂作为凝固剂。培养基配好后，应立即进行灭菌。
【实验用品】
1. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基、查氏培养基以及麦氏培养基。 2. 仪器及其它用品 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH 试纸，棉 花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹牛皮纸等。
【方法步骤】
一、牛肉膏蛋白胨培养基的配制
1. 称量 按配方计算实际用量后，称取各种药品放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放 在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放 入热中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
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2. 溶化 在烧杯中加入少于所需要的水量，置放在电热套上，小火加热，并用玻棒搅拌， 待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己 溶解的药品中，加热融化，最后补足所失的水分。
3. 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用lmol/L HCl 进行调节。pH 的调节 通常放在加琼脂之前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓 度。
4. 过滤 液体培养基可用滤纸过滤， 固体培养基可用4 层纱布趁热过滤， 以利培养的观察。 但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使 培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不 超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 6. 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状，大 小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的 作用。有些微生物需要更好的通气，则可用通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替 棉塞。
7. 包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉 塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸， 用绳扎好。然后用记号笔注明，培养基名称，组别，日期。
8. 灭菌 将上述培养基于 121℃，湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，应放入 冰箱内暂存。
9. 倒平板摆斜面 灭菌后，倒平板或制斜面，参照Ⅰ中介绍的方法。（如制斜面应趁灭菌 后未冷却前摆放成斜面，倒平板可放置到需要时，再加热溶化制作） 。
10. 无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24～48h，无菌生长即可使用，或贮 存于冰箱或清洁的橱内，备用。 二、高氏Ⅰ号培养基的配制
l. 称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水 将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。 再加入其他成分依次溶解。对微量成分 FeSO4∙7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加 入，方法是先在 1000mL 中加入 1g 的 FeSO4∙7H2O，配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液， 再在 1000mL 培养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分 到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2. pH 调节，分装，包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 三、查氏培养基的配制
参考高氏Ⅰ培养基的配制。
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四、麦氏培养基的配制
参考牛肉膏蛋白胨培养基的配制（麦氏培养基因含葡萄糖，灭菌条件为 113℃，20 min）。
【实验结果】
记录本实验配制培养基的名称，数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
【注意事项】
1. 称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2. 培养基配制加热过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。 3. 灭菌锅操作安全及摆斜面要求。
【实验报告】
1. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌，若不能及时灭菌应如何处理，已灭菌的培养
基如何进行无菌检查。
2. 试设计实验对饮料进行无菌检查。
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实验四 微生物形态特征的观察
【课前预习】
1. 接种技术及油镜操作技术；
2. 细菌、霉菌、酵母菌和放线菌的制片技术及形态特征比较。
第一部分 微生物菌落特征的观察
【目的要求】
1. 进一步熟悉和掌握微生物无菌操作技术；
2. 了解细菌、霉菌、酵母菌和放线菌的代表种类的菌落特征。
【基本原理】
微生物的菌落特征是指微生物在平板上生长，所表现出的群体形态特征。每一种类微 生物菌落具有各自相对稳定的特征，例如菌落的大小，菌落边缘形状、隆起形状、表面形 态，菌落透明或不透明等。这些特征可用于快速识别、鉴定微生物，在科研和生产实践中 常被采用。
图 31 微生物的培养特征
【实验用品】
1. 菌种 大肠杆菌（E.coli） 、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 、黑曲霉（Aspergillus
niger ） 、细黄链霉菌（streptomycs micuoflavus）斜面菌种。
2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏Ⅰ号培养基，查氏培养基，麦氏培养基。 3. 仪器或其他用具 接种环，接种针，涂布棒，酒精灯，无菌培养皿，电热恒温培养箱等。
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【方法步骤】
1. 制备菌悬液或孢子悬液 在培养好的斜面菌种内加入 5mL无菌水， 制成菌悬液后备用。 2. 制备单菌落 通过平板划线法获得细菌，酵母菌和放线菌的单菌落，用三点接种法获得
霉菌的单菌落（或通过梯度稀释涂平板法，参照Ⅰ）。
3. 培养 置入培养箱中培养，细菌 37℃、培养１d～2 d；霉菌 28℃、培养 3 d～5 d；酵母
菌 28℃、3 d～5 d；放线菌 28℃、培养5 d～7 d。 4. 观察 待长成菌落后，肉眼直接观察。
【实验结果】
填表：描述四大类微生物形态特征
项目 含水状态
菌落
形态 颜色 透明度 与培养基结合程度 细胞显微形态
气味 其它
细菌
放线菌
酵母菌
霉菌
【注意事项】
1. 接种后，平板应做好记号（班级、姓名、菌种名称和日期），并倒扣培养。 2. 观察平板菌落时，养成良好习惯，最好不要打开培养皿盖。
【实验报告】
设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别。
第二部分 细菌的单染色法及形态观察
【目的要求】
1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法； 2. 初步认识细菌的显微形态特征。
【基本原理】
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体 一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通
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常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分 子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染 色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料 有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正 电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
【实验用品】
1. 菌种 金黄色葡萄球菌，大肠杆菌。
2. 染色剂 吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。
3. 仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯）， 擦镜纸，生理盐水等。
【方法步骤】
1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取 1~2 环）生理盐水（或蒸馏水）于 玻片中央，用接种环以无菌操作（参照Ⅰ，图 11） ，分别从金黄色葡萄球菌球菌、大肠 杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物） 涂片，可用接种环挑取 2~3环直接涂于载玻片上（图41） 。 2. 干燥 室温自然干燥。
3. 固定 涂面朝上，通过火焰 2~3 次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以 固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
图 41 涂片、干燥和热固定
4. 染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 吕氏碱性美蓝染色 1~2min；石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约 1min。
5. 水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲 洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宣过急，过丸以免涂片薄膜脱落。 6. 干燥 自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 7. 镜检 涂片干后镜检。
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【实验结果】
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
【注意事项】
1. 载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜过厚。 2. 热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。 3. 涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
【实验报告】
1. 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
3. 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又如何
呢？
第三部分 放线菌的形态观察
【目的要求】
1. 学习并掌握观察放线菌形态的基本方法； 2. 初步了解放线菌的形态特征。
【基本原理】
放细菌菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝组成，制片时不采取涂片法，以免破坏 细胞及菌丝体形态。通常采用插片法或玻璃纸法结合菌丝体简单染色进行观察。在插片法 中，首先将灭菌盖玻片插入接种有放线菌的平板，使放线菌沿盖玻片和培养基交接处生长 而附着在盖玻片上，取出盖玻片可直接在显微镜下观察放线菌在自然生长状态下的形态特 征，而且有利于对不同生长时间的放线菌形态进行观察。在玻璃纸法中，采用的玻璃纸是 一种透明的半透膜，将放线菌菌种接种在覆盖在固体培养基表面的玻璃纸上，水分及小分 子营养物质可透过玻璃纸被菌体吸引利用，而菌丝不能穿过玻璃纸而与培养基分离，观察 时只要揭下玻璃纸转移到载玻片上，即可镜检观察。由于孢子形态、孢子排列及形状是放 线菌重要的分类学指标，可采用印片法将放线菌菌落或菌苔表面的孢子丝印在载玻片上， 经简单染色后观察。
【实验用品】
1. 菌种 细黄链霉菌（streptomycs micuoflavus）3 d～5 d培养平板。 2. 培养基 高氏Ⅰ号琼脂。
3. 仪器及其他用品 盖玻片，载玻片，镊子，接种环，显微镜，涂布器，玻璃纸，打孔器，
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显微镜，0.1%美蓝染色液，石炭酸复红染色液等。
【方法步骤】
1. 插片法
1）接种 用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上菌密集划线接种。
O
2）插片 无菌操作用镊子取灭菌盖玻片以约 45 角插入平板琼脂接种线上。
3）培养 将平板倒置，于 28℃培养 3 d～5 d。
4）镜检 用镊子小心取出盖玻片，用纸擦去背面培养物，在菌面朝上放在载玻片上， 通过显微镜直接用低倍镜镜检观察 2. 玻璃纸法
1）铺玻璃纸 无菌操作镊子将已灭菌（155℃～160℃）玻璃纸处平铺在平板表面，用 接种铲或无菌玻璃涂棒将玻璃纸压平并去除气泡，每个平板可铺约 10 块玻璃纸。
2）接种 无菌操作挑取菌种在玻璃纸上划线接种。 3）培养 将平板倒置，于 28℃培养 3 d～5 d。
4）镜检 在载玻片中央滴一小滴水，用镊子小心取出玻璃纸片，菌面朝上放在水滴上， 使其紧贴在载玻片上，勿留气泡，通过显微镜直接用低倍镜和高倍镜镜检。 3. 印片法
1）印片 用解剖针从平板培养物中划一块菌苔于载玻上，菌面朝上，用另一载玻片轻 轻在菌苔表面按压，使孢子丝及气生菌丝附着在载玻片上。
2）固定 将有印迹一面朝上，通过火焰 2 次～3 次固定。 3）染色 用石炭酸复红染色 1 min，水洗，晾干。 4）镜检 用油镜观察孢子丝形态特征。
【实验结果】
绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。
【注意事项】
1. 插片法镜检中，宜用略暗光线；先用低倍镜找到视野，再换高倍镜；在盖玻片菌体附着
部位滴加 0.1%吕氏美蓝染色后观察效果更好。 2. 玻璃纸法操作过程中，勿碰动玻璃纸菌面上的培养物。
3. 印片时不要用力过大压碎琼脂，也不要错动，以免改变放线菌的自然形态。
【实验报告】
镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
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第四部分 酵母菌的形态观察
【目的要求】
1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 2. 掌握酵母菌的一般形态及其与细菌的区别。
【基本原理】
单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大多数采取出芽方式进行无性繁 殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。由于细胞个体大，采取涂片的方法制片 有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法或水—碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽 生殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，其氧化型呈蓝色，还原型无色，由于细胞的新陈代谢作用， 细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还 原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色， 借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
【实验用品】
1. 菌种 酿酒酵母（Saccharomyes cerevisiae）约 2 d 的麦芽汁斜面培养物。 2. 培养基 PDA培养基，麦氏（McCLary）培养基。
3. 仪器或其他用品 显微镜，载玻片，擦镜纸，盖玻片，接种环，0.05%美蓝染色液（以 pH6.0 的 0.02mol/L磷酸缓冲液配制） ，碘液，0.04%的中性红染色液，0.5%沙黄液，95% 乙醇等。
【方法步骤】
1. 美蓝浸片的观察
1）在载玻片中央加一滴 0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量 酵母菌苔放在染液中，混合均匀。
2）用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液 上。
3）将制片放置 3 min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞 颜色区别死活细胞。
4）染色 30 min后再次观察，注意死活细胞比例是否发生变化。 5）用 0.05%吕氏碱性美蓝染液作为对照同时进行上述实验。 2. 水—碘液浸片法
将革兰氏染色用碘液用水稀释 4 倍后，滴加一滴于载玻片中央，无菌操作取少许菌体 置于染液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
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【实验结果】
绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
【注意事项】
美蓝浸片观察时，盖玻片不宜平着放下，否则可能产生气泡影响观察。
【实验报告】
1. 吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同， 对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原
因。
2. 酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性繁殖外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在
实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？若未观察到，试分析原因（提示：子囊孢子 的形成与培养条件有关）。
第五部分 霉菌的形态观察
【目的要求】
1. 学习并掌握观察霉菌形态的基本方法； 2. 了解四类常见霉菌的基本形态特征。
【基本原理】
霉菌菌丝体较大，为多细胞、丝状，分为营养菌丝体和气生菌丝体，有特化现象（如 假根、子实体等）。可以采取直接制片和透明胶带法观察，也可以采取载玻片培养观察法， 通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在盖玻 片和载玻片之间的培养基中生长，将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态 并可连续观察不同发育期的菌体结构特征变化。对霉菌可利用乳酸石炭酸棉蓝液进行染 色，盖上盖玻片后制成霉菌制片镜检。石炭酸可以杀死菌体及孢子并可以防腐，乳酸可保 持菌体不变形，棉蓝使菌体着色。同时这种霉菌制片不易干燥，能防止孢子飞散，用树胶 封固后可制成永久标本长期保存。
【实验用品】
1. 菌种 黑曲霉 （Aspergillus sp.） ， 青霉 （Penicfillium sp.） ， 根霉 （Rhizopus sp.） ， 毛霉 （Mucor sp.）2 d～5 d的马铃薯琼脂平板培养物。 2. 培养基 土豆琼脂或查氏琼脂。
3. 仪器或其他用品 无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U型玻棒，解剖针，解剖刀，镊 子，50%乙醇，20%的甘油、显微镜以及乳酸石炭酸棉蓝染色液等。
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【方法步骤】
1. 直接制片观察法
滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染液于载玻片上，用镊子从霉菌马铃薯琼脂平板培养物中取菌 丝，先放入 50%乙醇中浸一下，洗去脱落的孢子，然后置于染液中，用解剖针小心将菌丝 分开，去掉培养基，盖一盖玻片，用低倍镜和高倍镜镜检。 2. 透明胶带法
1）滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染液于载玻片上。
2）用食指与拇指黏在一段透明胶带两端，使透明胶带呈 U型，胶面朝下。 3）将透明胶带面轻轻触及菌落表面。
4）将黏在透明胶带上的菌体浸入载玻片上的乳酸石炭酸棉蓝染液中，并将透明带两端 固定在载玻片两端，用低倍镜和高倍镜镜检。 3. 载玻片培养观察法
1）培养小室准备及灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上面放一个 U型玻棒，在 U型玻棒上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，于 121℃灭菌 30 min， 烘干备用。
2）琼脂块制备：通过无菌操作，用解剖刀由马铃薯薄层平板上切下 1 cm2 左右的琼脂 块，将其移至培养小室的载玻片上，每片两块。
3）接种：通过无菌操作，用接种针从霉菌琼脂平板培养物中挑取很少量孢子，接种于 培养小室中琼脂块边缘上，将盖玻片覆盖在琼脂块上。
4） 培养： 通过无菌操作， 在培养小室中圆滤纸片上加3 mL～5 mL灭菌的 20%甘油 （用 于保持湿度），盖上皿盖，于 28℃培养。
5）镜检：根据需要于不同时间取出载玻片用低倍镜和高倍镜检。
【实验结果】
1. 结果
绘图说明四种霉菌的形态特征。
【注意事项】
直接制片观察法操作中，挑取和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖 玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
【实验报告】
你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
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实验五 细菌革兰氏染色法
【课前预习】
1. 油镜的使用方法；
2. 革兰氏染色的原理及注意事项。
【目的要求】
1. 掌握油镜的原理和使用方法； 2. 了解革兰氏染色原理；
3. 学习并掌握革兰氏染色的方法。
【基本原理】
1. Gram与革兰氏染色
革兰氏染色（Gram stain）是以丹麦医生 Hans Christain Joachim（18531938）的名字 命名的。Gram 在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定染料有很高 的亲和力。
革兰氏染色法的基本步骤是： a．初染：结晶紫染色； b．媒染：碘液媒染； c．脱色：乙醇脱色； d．复染：番红复染。
经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，达到了将细 菌与被感染的肺部组织区分开的目的。几年以后，德国病理学家 Carl Weigert（18451904） 在 Gram 染色方法基础上加上番红复染，使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之 一。 2. 基本原理
+
革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G ）和革兰氏阴性（G ）两种类型，细菌对
革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。首先利用草酸铵结 晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由 于碘与结晶紫形成碘结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用 95%乙醇 作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高， 壁厚且脂质含量低， 肽聚糖本身并不结合染料， 但其所具有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物， 现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网 孔收缩而使碘结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细 胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性 增加，原先滞留在细胞壁中的碘结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂
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（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。
可以明显看出阳性菌（左边）与阴性菌（右边）的细胞壁结构有明显的差异。阴性菌 的细胞壁上有着一层厚厚的肽聚糖，而阴性菌只有薄薄的一层，而且最外面还有一层膜。
【实验用品】
1. 菌种 大肠杆菌 16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物， 金黄色葡萄球菌 16h牛肉膏蛋白胨 琼脂斜面培养物。 （注：大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳 性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着上不同颜色，在显微镜下便于区别。同时，由 于两者具有不同的个体形态，在对它们的混合涂片进行革兰氏染色后，根据菌体颜色 和形态差异，可以判断染色是否成功。 2. 试剂 革兰氏染液，95%乙醇等。
3. 仪器和其他用品 酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸， 接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。
【方法步骤】
1. 涂片
将大肠杆菌（16h）和金黄色葡萄球菌（16h）分别涂片、干燥、固定。 2. 染色
1）初染 加草酸铵结晶紫一滴（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色 1～2min后倾去染液， 水洗至流出水无色；
2）媒染 先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖 1min，倾去碘液，水洗至流出 水无色。
3）脱色 用滤纸吸去玻片上的残水（从边缘吸，以防擦去菌体），将玻片倾斜，并衬 以白背景，用 95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约 20～30 秒，立即用水冲去乙醇；
4）复染 将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2min，水洗，吸去残水晾 干。 3. 镜检
干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌 呈红色。 4. 混合制片观察
一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。菌龄和脱色程度对染色结果影响较大。 获得本实验成功的关键：
1. 选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3. 脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
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A. 初染 B. 水洗 C. 媒染
D. 水洗 E. 脱色 F. 水洗 G. 复染 H. 水洗 I. 吸干
图 41 革兰氏染色程序
【实验结果】
1. 绘出油镜下观察的混合区菌体图像。
图 4-2 大肠杆菌染色结果
2. 填表
图 4-3 混片染色结果
表 41 结果记录表
菌名 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
28
菌体颜色
细菌形态
+ 结果（G ,G ）
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【注意事项】
1. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2. 加热时使用载玻片夹子及试管夹，以免烫伤。 3. 使用染料时注意避免沾到衣物上。 4. 使用乙醇脱色时勿靠近火焰。 5. 实验后洗手。
【实验报告】
1. 革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？
2. 现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴
性，如何确定你染色结果的正确性？
3. 为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？
4. 你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？
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实验六 微生物大小及数量测定
【课前预习】
1. 显微测微尺与血球计数板使用方法与原理； 2. 血球计数板的应用范围。
第一部分 微生物大小的测定
【目的要求】
1. 学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法；
2. 掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求， 增强对微生物细胞大小的感性认
识。
【基本原理】
微生物细胞的大小是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。其测量工具 有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻标准刻尺的载玻片，其尺度总长为 1mm，精确分为 10 个大格，每个大格又分为 10 个小格，共 100 小格，每一小格长度为 0.01mm，即 10μm。刻线外有一直径为Φ3，线粗为0.1mm的圆，以便调焦时寻找线条。 刻线上还覆盖有厚度为 0.17mm 的盖玻片，可保护刻线久用而不损伤。镜台测微尺并不直 接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有 等分为 50 小格和 100 小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显 微放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微 尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小 时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目 镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可 计算出细胞的实际大小。
图 51 镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺
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【实验用品】
1. 菌种 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和迂回螺菌的染色玻片标本。 2. 试剂 香柏油，二甲苯。
3. 仪器和其他用品 镜台测微尺，目镜测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸等。
【方法步骤】
1. 目镜测微尺的安装
取出接目镜， 把目镜上的透镜旋下， 将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上， 然后旋上目镜透镜，再将目镜插回镜筒内。
双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时目 镜测微尺一般都安装在右目镜中。 2. 校正目镜测微尺
将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻 度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜 测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域 内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的小格数。
用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之 间两尺分别所占的格数。
由于已知镜台测微尺每格长 10μm， 根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下， 目镜测微尺每格所代表的长度。
两对重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每小格长度（μm）= 两对重合线间镜台测微尺格数×103. 菌体大小的测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜 找到标本后，换油镜测定金黄色葡萄球菌的直径和枯草芽孢杆菌及迂回螺菌的宽度和长 两对重合线间镜台测微尺格数
×10×10 度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺 的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
值得注意的是，和动植物一样，同一种群中的不同细菌细胞之间也存在个体差异，因 此在测定每一种细菌细胞的大小时应至少随机选择 10 个细胞进行测量，然后计算平均值。
金黄色葡萄球菌只需测量其细胞的宽度（直径），而枯草芽孢杆菌和迂回螺菌应分别 测量细胞的宽度和长度，但应注意对杆菌可测量细胞的直接长度，而对螺菌测量的应是菌 体两端的距离而非细胞实际长度。 4. 测定完毕
测量完毕后取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别 用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。
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获得本实验成功的关键
1. 使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻尺外的圆圈线进行
准焦后再通过移动标本推进器进行寻找。
2. 细菌个体微小，在进行细胞大小测定时一般应尽量使用油镜，以减少误差。
3. 细菌在不同的生长时期细胞大小有时会有较大变化， 若需自己制样进行细菌细胞大小测
定时，应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料。
【注意事项】
1. 目镜测微尺很轻、很薄，在取放时应特别注意防止使其跌落而损坏。
2. 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必
十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。
【实验结果】
1. 表 51 目镜测微尺校正结果
物镜 低倍镜 高倍镜 油镜
物镜倍数 目镜测微尺格数
镜台测微尺格数
目镜测微尺每格代表的长度/μm
目镜放大倍数： 2. 表 52 金黄色葡萄球菌大小测定记录
1
金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 迂回螺旋菌
2
3
4
5
6
7
8
9
10
平均值μm
3. 表 53各菌测定结果计算和表述。
细菌名称 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 迂回螺菌 注：球菌用直径（宽度）表示细胞大小，杆菌和螺菌用宽度×长度表示细胞大小。 目镜测微尺 宽 每格代表的 目镜测微尺平 宽度 长度/μm μm 均格数 长 目镜测微尺平 长度 μm 均格数 菌体大小 【实验报告】
1. 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时， 必须用镜台测微尺重新校正对目镜测微尺？ 2. 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其
测定结果是否相同？为什么？
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第二部分 显微镜直接计数法测定微生物数量
【目的要求】
1. 明确显微镜计数的原理；
2. 学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
【基本原理】
显微计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种待定的具有确定容积的载玻片上（又 称计菌器），于显微镜下直接观察、计数的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计 数板、PeteroffHauser 计菌器以及 Hawksey 计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞（孢 子）悬液的计数，基本原理相同。其中血细胞计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相 对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，而后两种计菌器较薄，可用油镜对细菌等较小的 细胞进行观察和计数。显微计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结 果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的的活菌进行计数。目前已有一些方 法可以克服这些缺点，如结合活菌染色、微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方 法来达到只计数活菌体的目的，或用染色处理等杀死细胞以计数运动性细菌等。本实验以 最常用的血细胞计数板为例对显微计数法的具体操作方法进行介绍。
血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由 4 条槽构成 3 个平台。中间较宽的平台又 被一段横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分 9 个大方格， 中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成 25 个 中方格，而每个中方格又分成 16 小方格（图 52A）；另一种是一个大方格分成 16 个中方 格，而每个中方格又分成 25 个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中
2 的小方格都是 400 个。每一个大方格边长为 1mm，则每一个大方格的面积为 1mm ，盖上 3 4 盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm （10 mL）。
以 25 个中方格的计数板为例，设 5 个中方格中的总菌数为 A，菌液稀释倍数为 B， 则：1mL菌液中的总菌数= A 4
（×25×10 ×B 5
图 52 血球计数板侧面及两种类型的计数室
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【实验用品】
1. 菌种 酵母菌悬液。（注：显微镜直接计数法适宜对能在液体中均匀分散的微生物细胞 或孢子的数量进行直接计数。通常使用的血细胞计数板不适合使用油镜，因此本实验 推荐采用个体较大的酵母细胞及霉菌孢子作为实验材料，以保证实验的观察效果，使 学生能较快地掌握显微计数的原理和具体操作技术）。
2. 仪器和其他用品 普通光学显微镜，血细胞计数板，盖玻片，擦镜纸，酒精灯，无菌毛 细管，三角烧瓶。
【方法步骤】
1. 菌悬液制备
将 5mL 左右的无菌生理盐水加到酵母或霉菌培养基斜面上，用无菌接种环在斜面上 轻轻来回刮取。将制备的悬液倒入盛有 5mL 生理盐水和玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡 使细胞（孢子）分散。霉菌孢子液随后还应用无菌脱脂棉和玻璃小漏斗过滤，去掉菌丝。 上述悬液在使用前可根据需要适当稀释。 2. 检查血球计数板
在加样前，应先对血细胞计数板的计数室进行镜检。若有污物，可用自来水冲洗，再 用 95%的乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或用电吹风吹干。
计数板上的计数室的刻度非常精细，清洗时勿使用刷子等硬物，也不可用酒精灯火焰 烘烤计数板。 3. 加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液或 霉菌孢子液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，再用 镊子轻压盖玻片， 以免因菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室的容积。 加样后静置 5min， 使细胞或孢子自然沉降。
取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生。 4. 显微镜计数
将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在的位 置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一 般样品稀释度要求每小格内 510 个菌体为宜。 每个计数室选 5 个中格（可选 4 个角和中央 的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵 母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计 数室中计得的平均数值来计算样品含菌量。 5. 清洗
使用完毕后，将血细胞计数板及盖玻片按前面介绍的程序进行清洗、干燥，放回盒中， 以备下次使用。
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获得本实验成功的关键
1. 活细胞是透明的，因此在进行显微计数时应适当减低视野亮度，以增大反差。
2. 进行显微计数时应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，
再换高倍镜观察和计数。
【注意事项】
1. 使用酒精灯时注意不要被火焰灼伤或烧到衣物。
2. 取放过微生物培养物的接种环在放回试验台前应记得再次在火焰上灼烧灭菌， 以免造成
实验台污染。
3. 用接种环在培养基斜面上刮取时动作要轻，不要将琼脂培养基一起刮起。
【实验结果】
用表格记录结果：
表 54 显微计数结果
各中格中菌数 1 第一室 第二室 2 3 4 5 A B 二室平 均值 菌数/mL 【实验报告】
1. 根据你的体会， 说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误
差，力求准确？
2. 某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计 1～2 种可行的检测方法。
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实验七 噬菌体特异性溶菌试验
【课前预习】
1. 烈性噬菌体的复制周期； 2. 噬菌体的双层平板检测法。
【目的要求】
1.了解噬菌体裂解特异细菌的特点
2.掌握噬菌体的双层平板检测法并观察噬菌斑。
【基本原理】
噬菌体是寄生在细菌、放线菌体内的病毒。其专一性很强，如大肠杆菌的噬菌体，只 能裂解大肠杆菌，链霉菌的噬菌体只能裂解链霉菌。噬菌体的个体很小，已超过一般光学 显微镜的辨析范围，但通过噬菌体裂解特异细菌和放线菌的一些特点，如菌液由浊变清、 在含菌的固体培养基上出现空斑（噬菌体）等，可证明有噬菌体的存在。
【实验用品】
1. 菌种 大肠杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌 2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养液、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 3. 仪器设备用具 灭菌培养皿、灭菌吸管
【方法步骤】
1.液体培养基制备
培养基配方：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，水 1000mL，pH7.4～7.6。 按配方配制固体和液体试管培养基各 4 支，灭菌，备用。 2.接种
将液体培养基和固体斜面各两支，分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 3.培养
将接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面于恒温培养箱中 37℃培养 8 h，备用。 将接种后的液体培养基试管于震荡培养箱中 37℃培养 8h，注意观察菌液生长的浑浊 程度变化。将含噬菌体的菌液接入上述培养 8h 的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养液中， 37℃恒温振荡培养。由于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌被噬菌体裂解，菌液的浑浊度下降，
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这时噬菌体的数目不断增多，用此作为噬菌体悬浮液。 3.菌悬液制备
将在牛肉膏琼脂斜面上培养 8h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌加 4～5ml 的生理盐水， 制成菌悬液，备用。 4.双层平板制备
将已熔化冷至 45℃～50℃牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 10ml 倒入已灭菌的培养皿中，静 置待凝固；取含 1%琼脂的牛肉膏培养基 3～4ml，熔化后放入 45℃水浴中保温；另取细菌 悬浮液 0.5ml、含有噬菌体的悬浮液 0.2ml，与保温未凝固的 1%琼脂培养基充分混合后， 立即倒入已凝固的平板上摇匀作为上层（这种方法称为双层平板培养），待上层凝固后， 放入恒温培养箱中 37℃培养 24h。 5.噬菌斑观察
取出双层平板，观察噬菌斑。注意噬菌斑的形态特点。
【注意事项】
1. 斜面、液体、上层、下层培养基应按要求配制。 2. 要注意观察菌液培养和噬菌体裂解过程的浑浊度变化。 3. 双层平板的制作过程要注意控制好温度。
4. 细菌悬浮液、含有噬菌体的悬浮液与保温未凝固的 1%琼脂培养基的混合一定要充分。
【实验报告】
1、实验结果 1）噬菌斑数量 2）噬菌斑大小 3）绘图表示噬菌斑。 2、思考题
怎样辨别细菌培养液或菌落被噬菌体感染？
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实验八 微生物液体深层培养—发酵罐的使用
【课前预习】
1. 液体深层发酵的原理； 2. 发酵罐的使用方法。
【目的要求】
了解微生物液体深层培养的方法和设备的使用。
【基本原理】
好氧微生物的生长繁殖需充足的氧。为了进行大规模的工业生产，微生物需进行液体 深层培养，其氧的供给由空气系统完成， “通风搅拌”是最常用的方式。生产前，空气过 滤器至罐体以及其他与罐体相通的管道、培养基都需进行彻底地灭菌。然后，控制好微生 物培养所需的温度、风量、搅拌速度并接种，方可正常生产。
【实验用品】
1. 材料 玉米粉、豆饼粉
2. 试剂 K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H20、红曲霉液体菌种 3. 仪器 小型通风发酵罐
【方法步骤】
1. 准备工作
1）培养基的配制：玉米粉 5%，豆饼粉 2%，K2HPO4·3H2O 0.5%，MgSO4·7H20 0.1%， pH 自然。
2）检查本系统各单件设备，应确保各设备能正常运行时方可开机。 3）温度、pH、转速、消泡设定值的调节。 2. 空气过滤及空气管路的消毒
1）慢慢打开蒸汽阀门，排尽冷凝水。 2）蒸汽通过空气过滤器进入发酵罐内。 3）消毒时间一般为 30 分钟。 4）吹干空气过滤器需 20 分钟左右。 3. 空消
1）排尽夹套中的水。
2）排尽蒸汽管中冷凝水，使蒸汽徐徐进入发酵罐。 3）空消时间一般为 30～50 分钟。排尽发酵罐内的冷凝水。 4. 加培养基液
将培养基原液加入发酵罐内，并加水至所配培养液总量的 75～85%左右。
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5. 实消
1）排尽夹套中的水。
2）夹套预热：调节电机转速至 150rpm左右，进行慢速搅拌。
3）发酵罐内温度达到 80℃左右时，排尽蒸汽管中冷凝水，使蒸汽徐徐进入发酵罐。 4）当培养液温度达到 95～100℃后方可停止搅拌。 5）实消时间一般为 30 分钟。自然冷却10 分钟左右。 6）通冷却水进行冷却。
7）当罐内温度降至 70℃以下时，慢速搅动培养基。 6. 接种
1）当发酵液温度降到接种温度时即可进行接种。 2）准备合格的摇床菌种。 3）在接种口四周围上酒精棉。
4）点燃酒精棉，拧下接种口螺母，并将其放入预先准备的盛有酒精的培养基中。 5）将装菌种的瓶口在火焰上烧一会儿，在火焰下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内， 盖上接种口螺母，灭火焰。 7. 培养
按照工艺要求调节通气量、培养温度及搅拌转速。 8. 取样
蒸汽通过取样口，保持 20～30分钟，消毒后再取样。取完样再通蒸汽约5 min。 9. 出料
1）出料管的灭菌。 2）出料。
3）出料完毕后用蒸汽消毒出料管。 4）发酵罐应及时清洗干净。
5）如果发酵罐暂时不用，则需排尽罐内及各管道内的余水。 10. 发酵罐的清洗
1）关闭电源，旋下电机及个传感器的连线插头。 2）如果搅拌轴及机械密封装置不干净，则可用水冲刷。 3）安装完毕后，检查管道及发酵罐的密封性。
【注意事项】
1. 必须确保所有单件设备能正常运行时使用本系统。
2. 在过滤器消毒时，流经空气过滤器（金属滤芯）的蒸汽压力不得超过 0.17MPa，否则过
滤器滤芯会被损坏，失去过滤能力。
3. 在操作过程中，罐压不得超过 0.12MPa，防止引起设备的损坏。
4. 在空、实消升温过程中冷却按钮必须处于停止状态，否则当设定值设定在培养温度时，
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冷却水管中会自动通冷却水，不仅会影响升温速度、浪费蒸汽，更重要的是会引起冷 凝水过多，造成培养液的浪费。
5. 在空、实消结束后冷却时，发酵罐内严禁产生负压，以免损坏设备或造成污染。 6. 在发酵过程中，罐压应维持在 0.03～0.05MPa之间，以免引起污染。
7. 在各操作过程中，必须保持空气管道中的压力大于发酵罐的罐压，否则会引起发酵罐中
的液体倒流到过滤器中，堵塞过滤器芯或失去过滤能力。
【实验报告】
1. 以自己的理解写出发酵罐使用的基本流程。 2. 怎样防止由通风引起的发酵液污染？
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实验九 食品中大肠菌群的测定
【课前预习】
1. 典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？ 2. 食品中大肠菌群数测定的意义是什么？
【目的要求】
1. 学习和掌握大肠菌群的测定方法； 2. 了解测定过程中每一步的反应原理。
【基本原理】
大肠菌群是一群能在37℃培养48h内发酵乳糖产酸、 产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴 性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏 菌属等。大肠菌群数可用来判断水源或食品被粪便污染的可能性和程度。因为大肠菌群在 肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，抗逆能力稍强，在 数量上两者具有一定相关性，且大肠菌群易于培养和检测，所以非常适合用来作为判断样 品是否被人、畜粪便污染的标志。
大肠菌群的测定方法一般采用多管发酵法，此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产 气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品，经初发酵、平板分离和复发酵 3 个检测步骤，最后根据结果查最大自然数表，算出食品中的大肠菌群数。
【实验用品】
1. 被检样品 根据不同需要选择检检样品（如自来水、酱油、食醋、酸乳、啤酒等）。 2. 培养基 乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基。 3. 试剂 革兰氏染色液，芽孢染色液。
4. 其它 显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，德氏管，试管，刻度吸管，涂布 器等。
【方法步骤】
1. 初发酵试验
1. 2. 3 在三倍浓缩乳糖培养基中加入稀释度为10 10 10 的被检样品 10ml（如大肠菌群超
出检测限，则可取更高的稀释度） ，每个稀释度5 个重复，混匀置 37℃培养 24h。 2. 平板分离
培养 24h后如不产酸（乳糖发酵液变黄色）产气（小指管底部有气泡）和不变浑浊者 为阴性反应，产酸产气或仅产酸的乳糖发酵管为阳性反应，将阳性反应画线接种于伊红美 蓝平板上，37℃培养24h。
在伊红美蓝平板上大肠菌群的典型菌落为深紫黑色，具有金属光泽，或者紫黑色，不
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带或略带金属，或者淡紫红色，中心较深的菌落。将带有上述典型特征的菌落做革兰氏染 色镜检。 3. 复发酵试验
将上述革兰氏染色镜检为阴性无芽孢杆菌的菌落接种到乳糖蛋白胨培养基中，37℃培 养 24h。如仍为产酸、产气者为大肠菌群阳性。 4. 结果计算
根据 3 个稀释度中的阳性管数组成一个数量指标，查表 82 获得样品中大肠菌群的数 量。
表 91 大肠菌群最可能数（MPN）检索表
阳性管数 1ml（g）×3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.1ml（g）×3 0.01ml（g）×3
0
0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 阳性管数
1ml（g）×3
1
0.1ml（g）×3 0.01ml（g）×3
3
0 0
1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
MPN 100ml（g）
<30306090 306090 120 6090 120 160 90 130 160 190 4070 110 150 70 110 150 190 110 150 200 240 MPN 100ml（g）
160
<510
200 210
95%可信限 上限 <5
下限 90
<5 130
1030 230 360
30 360
95%可信限 上限
下限
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1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
200 240 290 90 140 200 260 150 200 270 340 210 280 310 420 290 360 440 530 230 390 640 950 430 750 1200 1600 930 1500 2100 2900 2400 4600 11000 >24000
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1030 360 370
3070 440 890
40 100 470 1500
4070 150 70 140 300 150 300 350 360 710 1500
1200 1300 3800 2100 2300 3800 3800 4400 4700 13000 24000 38000
注：1）本表采用3个稀释度（1毫升（克） 、0.1毫升（克）和0. 01毫升（克）） ，每稀释度3管。
2）表内所列检样量如改用 10 毫升（克） 、1 毫升（克）和 0.1 毫升（克）时，表内数字应相应 降低10倍；如改用0.1毫升（克） 、0.01毫升（克）和0.001毫升（克）时，则表内数字应相应增加 10倍。其余可类推。
【实验结果】
1. 将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。 2. 对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求的结论。
【实验报告】
1. 在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验？
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2. 典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？ 3. 食品中大肠菌群数测定的意义是什么？
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Ⅲ 综合性实验
实验十 苯酚生物降解菌的筛选
【课前预习】
1. 浓度梯度平板分离法、稀释平板涂布分离法； 2. 单碳源培养筛选法。
【目的要求】
1. 掌握微生物分离纯化的基本操作；
2. 掌握用选择性培养基从土壤中分离苯酚生物降解菌的原理和方法。
【基本原理】
苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造 成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。因此采用一定的方式降解苯酚，对保护人 类健康、消除环境污染意义重大。在提倡绿色环保的大前提下，采用生物降解的途径势在 必行。
微生物对污染物质的代谢、转化及降解作用，是当今环境污染研究中最活跃的领域之 一。自然界中能降解烃类的微生物有几百种，多为细菌、酵母菌和真菌，降解是由他们所 产生的酶和酶系统完成的，一般直链化合物比支链化合物、饱和化合物比非饱和化合物、 脂肪烃比芳香烃容易被较多种类的微生物降解和同化。直链烃的降解是末端甲基被氧化形 成醇、醛后再生成脂肪酸，由脂肪酸形成醋酸，最后氧化成二氧化碳和水，微生物对单环 芳烃及其衍生物的降解与直链烃类似， 能降解苯和酚的微生物种类很多， 细菌中的很多属， 放线菌等。
苯酚是卤代芳香烃化合物。苯酚是常用的表面消毒剂之一，它们是 TCA（三羧酸）循 环的抑制剂。现已发现某些假单胞菌、争论产碱菌、真养产碱菌含有芳香烃的降解质粒， 将其降解生成琥珀酸、草酰乙酸、乙酰 CoA，进入 TCA循环。
在苯酚浓度梯度培养基平板高含药区上分离出的菌落，对苯酚具有较好的耐受性，可 能具有分解酚菌的能力；然后将其在以苯酚为唯一碳源的培养基里进行摇床培养，淘汰掉 不能利用苯酚的菌株，可筛选到苯酚降解菌；再用不同浓度的苯酚药物培养基分离，可筛 选出耐受能力好，降解程度高的苯酚降解菌。
【实验用品】
1. 材料 （样品） 实验土样采自校园肥沃土。
2. 器材和仪器 试管、250ml 三角烧瓶、1 mL 吸管、吸耳球、无菌涂棒、量筒、天平、
灭菌锅、培养箱、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸。
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3. 试剂 牛肉膏 蛋白胨 苯酚 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 FeSO4 4. 培养基
琼脂
A. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g，NaCl 5g ， 琼脂 1520g , 水 1000 mL， PH 7.07.5；
B. 药物培养基：将一定量苯酚加入到牛肉膏蛋白胨培养基中制成。
C. 苯酚浓度梯度平板：在无菌培养皿中，先倒入 710 mL 含 0.1g/L苯酚的牛肉膏蛋 白胨培养基，将培养皿一侧置于木条上，使培养皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住 培养皿底部；待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入 7~10 mL牛肉膏蛋白胨培养基。
D. 以苯酚为单碳源的液体培养基：NH4Cl 1.0g ，K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4
0.06g,，FeSO4 3mg，苯酚按设计量添加，水1000 mL ，PH 7.07.5。
【方法步骤】
1. 苯酚耐受菌株的初选
1）浓度梯度培养基平板制备：按培养基C的方法制成苯酚浓度梯度平板； 2）样品菌悬液制备：将采集的土样溶解于无菌水中，摇匀，作适度稀释，备用； 3）平板涂布：用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液0.2mL于苯酚梯度平板上， 用涂棒涂布均匀；
4）培养：恒温培养箱30℃培养12天；
5）挑取菌落：由于在培养基平板中，药物浓度呈由低到高的梯度方式分布，平板上长 成的菌落也呈现由密到稀的梯度分布，而高浓度药物区生长的少数菌落一般具有较强的抗 药性。挑取高含药区的单个菌落于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上划线；
6）培养、保藏：将接种后的斜面于恒温培养箱中30℃培养12天，编号，4℃冰箱保藏。 2. 以苯酚为单碳源的菌株的筛选
1）单碳源培养基配制：按培养基D的配方，用250mL三角瓶，每瓶装50mL，制成以苯 酚为单碳源的液体摇瓶；
2）苯酚的浓度设定：苯酚的浓度分别按0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，0.8g/L，1.0g/L，1.2g/L 六个浓度梯度配制；
3）平行样：每菌株、每药物浓度各配置平行样两瓶； 4）灭菌：121℃，20min；
5）接种：将初选的苯酚耐受性菌株，分别用少许无菌水稀释，接种于对应摇瓶中； 6）培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，30℃，100转/min培养2天；
7）检测：用分光光度计测定OD值，以空白培养基作对照，检测各摇瓶菌体浓度； 8）筛选：淘汰掉不能利用苯酚为碳源的菌株。菌体浓度高的为生长较好者，即能以苯 酚为单碳源的菌株，可进行下一步实验。 3. 高耐受性苯酚降解菌的筛选
1）药物培养基平板的配制：按不同浓度（0.2 g/L，0.4 g/L，0.6 g/L，0.8 g/L，1.0 g/L，
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1.2 g/L）苯酚配置药物培养基平板；
2）灭菌、倒平板：121℃，灭菌20min，倒平板，各菌株、各浓度配置两个；
3）菌悬液制备：将初选的培养液作适度稀释，或将保藏的经单碳源实验的菌株用无菌 水制成菌悬液；
4）涂平板：用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液0.2mL涂布于药物培养基平 板上，每一试管菌悬液涂布一组不同浓度的苯酚药物培养基平板，每一浓度设平板两个， 六组共计12个；
5）培养：恒温培养箱30℃培养12天；
6）筛选：观察、记录并挑选高浓度药物培养基平板上生长旺盛的菌落，此即高耐受性 苯酚降解菌，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面；
7）保藏：编号，4℃冰箱保藏。
【实验结果】
1. 苯酚耐受菌株的初选结果
平板编号 药物浓度（g/L） 高药区单菌落数
1 0.1
2 0.1
3 0.1
4 0.1
5 0.1
6 0.1
7 0.1
8 0.1
2. 以苯酚为单碳源的菌株的筛选结果（生长情况 OD值）
药物浓度 （g/ L）
1 2
菌种编号
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
3 4 5
3. 高耐受性苯酚降解菌的筛选结果（菌落数）
药品浓度（g/L）
1
菌株号
2 3 4 5
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
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【注意事项】
1. 各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是苯酚的称量和 pH； 2. 涂布梯度平板的菌悬液只作适度稀释，菌浓度不必过低； 3. 涂布平板的菌悬液不要过多或过少，0.2mL为宜； 4. 梯度平板上挑取菌落时，要挑取单菌落；
5. 单碳源实验的培养基和培养条件一定要严格把握。
【实验报告】
1. 用三线表记录实验步骤13所得的实验结果。 2. 实验结果分析。 3. 菌体、菌落形态的描述。
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实验十一 乳酸菌的分离与鉴定
【课前预习】
1. 乳酸菌的特性及其益生机理； 2. 发酵中乳酸检测原理与方法。
【目的要求】
1. 掌握从新鲜酸乳分离乳酸菌的原理与方法； 2. 了解乳酸菌的革兰氏染色及产酸等主要特征。
【基本原理】
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，是一 群相当庞杂的细菌，至少可分为 18 个属，共有 200 多种。除极少数外，其中绝大部分都 是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中，目前，已 被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，它能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因 此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。
酸奶，一般指酸牛奶，它是以新鲜的牛奶为原料，经过马氏杀菌后再向牛奶中添加有 益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。目前，市场上酸奶制品多以凝 固型、搅拌型和添加各种果汁果酱等辅料的果味型为多，一般添加有保加利亚乳杆菌、嗜 热链球菌和嗜酸乳杆菌等益生菌种。以酸奶为原料，可从中分离得到乳酸菌。
微生物的分类鉴定分为 4 个不同水平：一是细胞的形态与习性水平，包括观察微生物 形态、运动性、营养要求、生长条件、代谢特性、致病性等；二是细胞组分水平，包括细 胞壁、脂类和光合色素等的分析；三是蛋白质水平；四是核酸水平，包括 G+C mol％值的 测定，核酸分子杂交，16S 或 18S rRNA 寡核苷酸分析等。在对菌株进行初步鉴定时，通 常采用方法是形态特征和生理生化鉴定，如果要得到更准确的结果，可提取微生物DNA， 利用 PCR 技术和测序技术对其16S rDNA序列进行分析比对。
【实验用品】
1. 样品 新鲜酸乳或乳酸饮料，市场购买。
2. 培养基 BCG 牛乳培养基，乳酸菌培养基，脱脂乳试管。
3. 仪器或其他用具 恒温水溶锅，酸度计，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养箱，酸乳 瓶（200～280mL） ，培养皿，试管，三角瓶，显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，脱 脂乳粉，鲜牛奶，蔗糖，碳酸钙等。 （测定乳酸试剂及配制见附录）。
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【方法步骤】
一、菌种的分离
5
1. 样品稀释 取市售新鲜酸乳（或泡制酸菜的酸液），梯度稀释至 10 。
4 5 2. 接种 取其中的 10 、10 稀释液各 0.1 mL～0.2 mL，分别接入 BCG 牛乳培养基琼脂
平板上，用无菌涂布棒依次涂布均匀。（或者直接用接种环蘸取原乳液，于平板上划线 分离。）
3. 培养观察 置 40℃恒温箱中培养 48 h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基 变为黄色者，初步定为乳酸菌。 二、菌种的初步鉴定
1. 脱脂乳试管鉴定 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养 8 h～24 h若牛乳 出现凝固，无气泡，呈酸性者进一步判断为乳酸菌。 （脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液 或按脱脂乳粉与 5%蔗糖水为 1：10 的比例配制，装量以试管的 1/3 为宜，115℃灭菌 15min）。
2. 镜检鉴定 细胞为杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性，为乳酸菌。
3. 保藏 将分离到的菌株连续传代 2～3 次，最终选择性能稳定，能在 3 h～6 h凝固的牛 乳管，冷藏，作菌种待用。
4. 乳酸发酵及检测鉴定 在无菌操作下将分离的 1 株乳酸菌稀释，接种于装有300 mL乳 酸菌培养液的 500 mL三角瓶中，40℃～42℃静止培养。实验分 2 组，一组在接种培养 后，每 6h～8 h取样分析，测定 pH 值。另一组在接种培养 24 h后每瓶加入 CaCO3 3 g （以防止发酵液过酸使菌种死亡） ，每 6 h～8 h取样，对乳酸进行定性定量检测，并记 录结果。
5. 乳酸定性测定 取 10 mL 酸乳上清液的于试管中，加入 10% H2SO4 1 mL，再加 2% KMnO4 1 mL，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的滤纸条搭在试 管口上，微火加热试管至沸，若滤纸变黑，则说明有乳酸存在（加热使乙醛挥发）。 6. 乳酸定量测定 取稀释 10 倍的酸乳上清液 0.2mL，加至 3 mL pH9.0 的缓冲液中，再加 入 0.2 mL NAD 溶液，混匀后测定OD340nm，值记为 A1，然后加入 0.02 mL L（+）LDH， 0.02 mL D（）LDH，25℃保温 l h后测定OD340nm，值记为 A2。同时用蒸馏水代替酸 乳上清液作对照，测定步骤及条件完全相同，测出的相应值为 Bl 和 B2。计算公式如下： 乳酸/g∙（100mL）1 =（V×M×△ε×D）÷1000×ε×L×Vs
V：比色液最终体积（3.44mL） M：乳酸的克分子重量（lmol/l=90g） △ε：（A2A1）（B2B1） D：稀释倍数（10）
3 1 l
ε：NADH 在 340nm吸光系数（6.3×10 ×l×mol ×cm ）
L：比色皿的厚度（0.1cm） Vs：取样体积（0.2mL）
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三、16S rDNA序列分析鉴定（分子生物学内容，有条件可做） 1. 模板 DNA的提取
1）挑取单菌落接种至 50 mL MRS 液体培养基中，28℃、180 r/min摇床培养 24 h； 2）取 1.5 mL培养物离心，12000 r/min、1 min收集菌体，加入 STE 缓冲液，用吸管反 复吹打使之重悬，再次离心，菌体重悬于 1 mL STE 溶液中；
3）加入 100 mg/mL溶菌酶溶液 1 μL（终浓度为100 μg/mL），37℃保温 1 h～2 h； 4）加入 1/10 体积10% SDS 溶液，混合均匀，静置片刻，60℃～65℃水浴，不超过 10 min；
5）加入 1/10体积 5 mol/LNaCl，至终浓度为1 mol/L，充分混匀；
6）加入等体积的 Tris 平衡酚，混匀，12000 r/min离心 5 min，取上清于另一洁净离心 管中，重复操作一次；
7）上清液中加入等体积的氯仿，混匀，离心 12000 r/min、5 min，取上清于另一个洁 净的离心管中；
8）加入 2 倍体积的无水乙醇沉淀，20℃静置 30 min 以上，离心，12000 r/min、 5 min； 9）70%乙醇洗涤 2次，室温晾干； 10）冷冻抽干，于20℃保存备用。 2. 16S rDNA的 PCR扩增
以提取的各菌株的DNA为模板，采用通用引物 P0（5’GAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’）和 PC3（5’CTAHAGGGTATCTAATCCT3’），扩增各菌株的 16S rDNA序列，PCR 反应体系见表 9.1。
表 71 PCR 反应体系的配制
反应物
10×Buffer（含MgCl2） dNTP（10 mmol/L） P0 （100 mmol/L） PC3（100 mmol/L） 模板DNA Taq酶 ddH2O
加入体积（mL） 2.5 2.5 0.75 0.75 1.0 0.25
补加到总体积25mL
终浓度 1× 1 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L ＜1 mg
PCR 程序为：94℃预变性 3 min，94℃变性 1 min，45℃复性 1 min，72℃延伸 1 min， 循环 30 次，72℃延伸8 min，4℃保温 3 min。PCR 扩增结果，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 3. PCR 产物的纯化及序列分析
PCR 产物按 Omega BioTek公司试剂盒操作方法纯化后，寄给北京奥科生物技术有限 公司或上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序，测序引物为 P0、PC3。将序列结果 提交到 GenBank 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST） 中搜索比对。
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【实验结果】
1. 分离与初步鉴定结果
菌株编号
1 2 3 4 5
来源
菌落形态
革兰氏染色
是否产酸
其它
2. 乳酸发酵检测
发酵时间h pH值 乳酸含量 g/100ml
h h h h h 【注意事项】
采用 BCG 牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合 镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
【实验报告】
1. 发酵酸乳为什么能引起凝乳？
2. 试设计一个从泡菜中分离纯化乳酸菌的程序。
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实验十二 紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应
【课前预习】
紫外线诱变的机理。
【目的要求】
1. 观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应； 2. 学习并掌握物理诱变育种的方法。
【基本原理】
物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限 制，难以普及。一般用于诱变育种的物理因子有快种子、60 Co、γ射线和高能电子流 β射 线等。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几 十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后 得到的高单位抗生素产生菌种中， 有 80％左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。 因此， 对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。
紫外线的波长在 200～300nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是 253～265nm，一般 紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有 80％是 254nm。 紫外线诱变的主要生物学效应是由于 DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤 更为敏感。紫外线引起 DNA结构变化的形式很多，如 DNA链的断裂、碱基破坏。但其最 主要的作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对， 从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的 DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免 长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需要黑纸或黑布包裹。另外，照射处 理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
【实验用品】
1. 菌种 枯草芽孢杆菌
2. 培养基 肉膏蛋白胨固体培养基、淀粉培养基。
3. 药品及用具 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、碘液、试管、移液管、三角瓶、 量筒、烧杯、20W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机等。
【方法步骤】
1. 诱变
取已培养 20h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用 10ml 生理盐水将菌苔洗下，并倒入 盛有玻璃珠的三角瓶中，强烈振荡 10min，以打碎菌块，离心（3000r/min）15min，弃去 上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤 2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直
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接计数。调整细胞浓度为 10 cfu/ml。
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将淀粉琼脂培养基熔化后，冷至 45℃左右倒平板，凝固后待用。正式照射前开启紫外 灯预热 10min。取制备好的菌悬液4ml 移入 6cm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒， 置磁力搅拌器上，20W 紫外灯下30cm处。 然后打开皿盖边搅拌边照射， 剂量分别为 1min， 2min，3min。可以累积照射，也可以分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。
在红灯下分别取未照射的菌悬液（作为对照）和照射过的菌悬液各 0.5ml 进行不同程 度的稀释。取最后 3个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个稀释度涂 3 个平板， 每个平板加稀释液 0.1ml，用无菌玻璃涂布棒涂匀，37℃培养 48h（用黑布包好平板）。注 意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别、座位号。 2. 计算存活率及致死率
将培养 48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品 1ml 菌 液中的活菌数。
存活率＝（处理后 1ml 菌液中活菌数/对照 1ml 菌液中活菌数）×100 同样计算用紫外处理1. 2. 3 min后的存活细胞数及致死率。
致死率＝（对照 1ml 菌液中活菌数－处理后 1ml 菌液中活菌数）/对照 1ml 菌液中活 菌数×100。 3. 观察诱变效应
在平板菌落计数后，分别向菌落数在 5～6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围 将出现透明圈，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值（HC 值），与对照平板进行比 较，根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶诱变的效果，选取 HC比值大的菌落移 接倒新鲜牛肉膏斜面上培养。此斜面可作复筛用。
【实验结果】
将实验结果按表要求如实填入，并分别算出存活率，致死率。
稀释倍数 处理时间/min O对照 1
紫外线
2 3 平均菌数/皿 最后三个稀释度 存活率％ 致死率％ 【注意事项】
紫外操作应在暗室中或晚上进行，诱变后，应避光保存菌种，避免回复突变。
【实验报告】
1. 紫外线诱变需注意的事项是什么？ 2. 紫外线诱变的机理是什么？
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实验十三 柠檬酸液体深层发酵和提取
【课前预习】
1．柠檬酸生物合成途径；
2．微生物菌种的分离纯化、自然选育； 3．发酵产品的沉淀分离法； 4．通风搅拌发酵罐的原理和使用。
【目的要求】
1．掌握微生物菌种分离纯化、自然选育的基本操作； 2．掌握通风搅拌发酵罐的使用和发酵过程的控制；
3．掌握发酵产品的过滤、沉淀分离、离交、浓缩、结晶、干燥等提取方法。
【基本原理】
柠檬酸又名枸橼酸，英文名 Citric acid，原义是存在柠檬酸等水果中的一种有机酸， 柠檬酸学名为 3—羟基—3—羧基戊二酸。柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒，或白色晶 性粉末，无臭，是生物体主要代谢产物之一。温度低于 36.3±0.15℃时，从水溶液中结晶 的柠檬酸带有分子的结晶水，分子量为210.4，斜方晶系；温度高于 36.5±0.15℃时，从水 中结晶的柠檬酸不带结晶水，分子量为192.13，单斜晶系全对称晶类。柠檬酸极易溶于水、 乙醇，难溶于乙醚等有机溶剂。
国内的柠檬酸发酵多以黑曲霉为菌种，黑曲霉中存在 EMP 途径、丙酮酸羧化和 TCA 循环中所有的酶，葡萄糖经过 EMP 途径、丙酮酸羧化和 TCA循环形成柠檬酸。柠檬酸的 合成分成两个阶段：
① ②
一分子的葡萄糖形成两分子的丙酮酸，反应式为： C6 H12 O6 ＋ 2ADP + 2PI → 2C 3H4 O3 + 2ATP + 2H2 由两分子的丙酮酸合成一分子柠檬酸，反应式为： C 3H4 O + H 2O → C 6H 7O 8 + H2
合并两个阶段得反应式：
C6 H12 O6 + H 2O + 2ADP +2PI →C 6H 7O 8 + 2 ATP + 3 H2。
柠檬酸合成途径：
EMP
葡萄糖
丙 氧化脱羧 乙酰 COA 酮 酸
羧化
→柠檬酸
草酰乙酸
通常情况下，柠檬酸不会在细胞内积累，柠檬酸积累是菌体代谢失调的结果。其条件
4+ 2+ 为： ①磷酸盐的浓度低 ②氮源用 NH 盐 ③pH 值低 （低于 2.0） ④溶氧量高 ⑤Mn 、Fe 2+ 、
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2+ 4+ Zn 含量极低。其机理为：①由锰缺乏抑制了蛋白质合成而导致细胞内NH 浓度升高和一
条呼吸性强的侧系呼吸链不产生 ATP，分别解除了对磷酸果糖激酶的代谢调节，促进了
2+ EMP 途径的畅通。②由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。③在控制 Fe 含量
的情况下，乌头酸水合酶活性低而不能及时转化柠檬酸。④一旦柠檬酸浓度升高，就会抑 制异柠檬酸脱氢酶，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。 柠檬酸生物合成代谢调节的特点：
1）TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没 有调节作用，这是黑曲霉 TCA环的第一个特点。
2）第二个特点：黑曲霉菌体内α酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。 3）氧和 pH 值对柠檬酸发酵的影响很大。
本实验通过对柠檬酸生产菌种的分离纯化、自然选育，以玉米淀粉等淀粉类物质为原 料，采用小型通风搅拌发酵罐（10L）发酵，应用过滤、沉淀分离、离交、浓缩、结晶、 干燥等提取方法得到柠檬酸成品。
【实验用品】
1．菌种：黑曲霉。
2．仪器和设备：试管、500ml 三角烧瓶、茄子瓶、培养皿、1 mL吸管、吸耳球、无菌涂
棒、量筒、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、天平、灭菌锅、培养箱、摇床、 小型通风搅拌自控发酵罐（10L）、小型板框过滤机、不锈钢罐、恒温水浴、搅拌机、 离子交换柱、旋转蒸发器、恒温干燥箱。
3．原料、试剂：玉米粉 麦芽 麸皮α淀粉酶 琼脂 碳酸钙 硫酸 4. 培养基
A. 麦芽汁琼脂斜面
按 1.5%的比例将琼脂加进麦芽汁中，加热溶解，pH6.4，然后将此培养基分装试管中。 高压灭菌：110℃，30 分钟。 B.三角瓶麸皮孢子培养基：
麸皮 1000 g，碳酸钙100 g，硫酸铵 10 g适量加水装入 500ml 三角烧瓶、灭菌。 C. 种子培养基：
2325％玉米粉调浆, 加α淀粉酶，75℃，pH7.07.5 ，加 CaOH（蛋白质沉淀），9095 ℃保温，调节 pH5.2，（DE 值 达 25％），过滤，得淀粉水解糖液，配渣。 D. 发酵培养基：
325％玉米粉调浆, 加α淀粉酶，75℃，pH7.07.5 ，加 CaOH（蛋白质沉淀），9095 ℃保温，调节 pH6.0，（DE 值 达 25％），过滤，得淀粉水解糖液。
【方法步骤】
1. 菌种的分离纯化、自然选育
1）转管培养； 2）孢子悬液制作； 3）梯度稀释；
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4） 平板涂布： 用1mL移液管分别从各孢子悬液试管中取菌悬液0.2mL于培养基平板上， 用涂棒涂布均匀；
5）培养：恒温培养箱35℃培养45天； 6）挑菌落：挑取颜色深、产孢子多的菌落；
7）培养、保藏：将接种后的斜面于恒温培养箱中35℃培养45天，编号，4℃冰箱保 藏；
8）摇瓶培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，35℃，100转/min培养3天；
9）产酸性能测定：取滤液1mL，用0.143N NaOH滴定总酸，选取产酸性能好的菌株； 10）传代检验。 2.斜面、麸曲种培养
1）斜面培养基配制：按培养基A的配方，制作斜面； 2）转管培养；
3）三角瓶麸皮孢子培养基配制：按培养基B的配方，制作三角瓶麸皮孢子培养基； 4）灭菌：121℃，20min；
5）接种：将斜面孢子用无菌水稀释，接种于麸曲瓶中； 6）培养：八层纱布盖口，35℃，培养9天，两小时摇动一次； 7）检测：观察产孢子多少和孢子颜色。 3. 种子培养（摇瓶代替）
1）种子培养基配制：按培养基C的配方，制作种子培养基，分装于500mL三角瓶中； 2）灭菌：121℃，灭菌20min；
3）接种：用无菌水将麸曲孢子制成孢子悬液，按1‰接种于摇瓶中； 4）摇瓶培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，38℃，100转/min培养20小时； 5）镜检：显微镜观察，处于快速生长期，可用于接种。 4. 发酵
1）培养基：玉米淀粉水解糖，总糖 15％ ，pH6.0； 2）空消：发酵罐、分过滤器，130℃，30分；
3）实消：进料，夹套加热至80℃，直接进蒸汽至125℃，1520分； 4）接种：冷却至42±1℃，接种子罐（摇瓶）菌种10％；
5）培养：温度：39±1℃，罐压：0.1Mpa， 风量：1：0.1 0.15，转速：90/min，发 酵周期：5560小时。
6）检验：测定还原糖，1小时1次，耗完放罐。 5. 柠檬酸提取
1）发酵液过滤：板框过滤机，进料65±2℃ 洗水75±2℃，洗至柠檬酸＜1％； 2）中和：滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残糖以及蛋白质、金属离子等杂质。 利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离的过程，加热至7075℃，加入碳酸钙中和至 pH6.1；
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3）过滤、洗糖：真空抽滤，90℃热水洗至无糖；
4）酸解：中和所得钙盐经过滤、洗涤，加硫酸酸解，同时加0.5％粉末活性炭脱色， 加热至90℃反应30分钟，至pH1.5，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀；两管清检测终点：两试管 分别加20％CaCl2、20％H2SO4，煮沸、冷却、加酒精，观察有无沉淀。
5）过滤、洗酸： ，滤液含较纯的柠檬酸，真空抽滤，90℃热水洗至无酸； 6.柠檬酸精制
1）离子交换：
阳离子交换：主要除钙离子、铁离子；终点控制，黄血盐检验铁。
阴离子交换：主要除硫酸根、氯离子；终点控制，AgNO3 检验 Cl ，BaCl2 检验 2 SO4 。
2）蒸发浓缩：旋转蒸发器，7075℃；终点控制，比重 1.3451.36。 3）结晶分离：分批冷却结晶；36.5℃，12 小时，过滤、分离。 4）干燥包装：真空干燥器干燥，质检、装袋、封口。
【实验结果】
1．柠檬酸的纯度； 2．柠檬酸的总收率； 3. 发酵产酸率。
【注意事项】
1．各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是发酵培养基； 2．各种仪器、设备的正确使用，尤其是发酵罐； 3. 各工序的终点控制参数和检测方法；
4. 培养基和设备的灭菌要彻底，尤其是空气系统； 5. 各工序的温度等反应条件应严格控制。
【实验报告】
1. 用三线表记录实验各步骤所得的柠檬酸产率或得率。
柠檬酸浓度
发酵 过滤 中和 酸解 离子交换 蒸发浓缩 结晶分离
2. 实验完成的主要指标。 实验步骤
指标1
指标2
指标3
柠檬酸总量
产率或得率
损失率
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菌种选育 斜面、麸曲种培养 种子培养 发酵 板框过滤 中和 酸解 精制
挑菌落数 转管培养长势 接种孢子浓度 培养基总糖 进料温度 中和pH 酸解pH
离交液铁、Cl
摇瓶产酸率 麸曲种培养长势 培养时间 放罐还原糖 洗水温度 碳酸钙加量 两管清结果 浓缩液比重
选取菌株数 孢子多少和颜色 镜检结果 培养时间 洗水酸含量 洗水含糖量 洗水酸含量 结晶温度、时间
3. 实验结果分析。 1）育种；
2）发酵产酸率；
3）柠檬酸的总收率和各工序收率； 4）柠檬酸的纯度。
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Ⅴ 附 录
附录1 实验室意外事故的处理
1. 火险
立刻关闭电门、煤气，使用灭火器，沙土和湿布灭火酒精、乙醚或汽油等着火使用灭 火器或沙土或湿布覆盖，慎勿以水灭火;衣服着火可就地或靠墙滚转。 2. 破伤
先除尽外物，用蒸馏水洗净，涂以碘酒或红汞。 3. 火伤
可涂5%鞣酸、2%苦味酸或苦味酸铵茉甲酸丁酯油膏，或龙胆紫液等。 4. 灼伤
（1）强酸、溴、氯、磷等酸性药品的灼伤，先以大量清水冲洗，再用5%重碳酸钠或 氢氧化铵溶液擦洗以中和酸。
（2）强碱、氢氧化钠、金属钠、钾等碱性药品的灼伤，先以大量清水冲洗，再用5% 硼酸溶液或醋酸冲洗以中和碱。以浓酒精擦洗。
（3）眼灼伤 眼为碱伤，以5%硼酸溶液冲洗然后于滴入橄榄油或液体石蜡12 滴以滋 润之。眼为酸伤， 以5%重碳酸钠溶液冲洗，然后再滴入橄榄油或液体石蜡12 滴以滋润 之。
5. 食入腐蚀性物质
（1）食入酸 立即以大量清水漱口，并服镁乳或牛乳等，勿服催吐药。
（2）食入碱 立即以大量清水漱口，并服5%醋酸、食蜡、柠檬汁或油类、脂肪。 6. 吸入菌液
（1）吸入非致病性菌液，用40%乙醇漱口，并喝大量烧酒，再服用催吐剂使其吐出。 （2）吸入致病性菌液，立即大量清水漱口，再以1：1000 高锰酸钾溶液漱口。 （3）吸入葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌液，立即以大量热水漱口，再以消毒液1：5000 米他芬，3%过氧化氢或1：1000 高锰酸钾溶液漱口。
（4）吸入白喉菌液 经上法处理后，并注射1000 单位的白喉抗毒素以预防。 （5）吸入伤寒、霍乱、痢疾、布氏等菌液经上法处理后，并注射疫菌及抗生素以预 防患病。
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附录2 常见培养基的配制
1．牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养）
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.4～7.6。 2. 高氏1 号培养基（用于放线菌培养）
可溶性淀粉20g，KNO3 1g ，NaCl 0.5g ，K 2HPO4∙3 H2O 0.5g，MgSO 4∙7 H2O 0.5g，FeSO4∙7 H2O 0.01g，水1000mL，pH7.4～7.6。配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入 到以上培养基中。
3．马丁氏（Martin）培养基（用于从土壤中分离真菌）
K2HPO4 1g，MgSO 蛋白胨5g， 葡萄糖10g，1/3000 孟加拉红水溶液100mL， 4∙7 H2O 0.5g， 水900mL， 自然pH，121 ℃湿热灭菌30min。 待培养基融化后冷却55～60℃时加入链霉素 （链 霉素含量为30μg/mL）。
4. 马铃薯培养基（PDA）（用于霉菌或酵母菌培养）
马铃薯（去皮）200g，蔗糖（或葡萄糖） 20g，水1000mL，配制方法如下：将马铃
2
署去皮，切成约2cm 的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，
然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足至1000mL，自然pH。霉菌用蔗糖，酵母菌 用葡萄糖。
5. 察氏培养基（蔗糖硝酸钠培养基）（用于霉菌培养）
蔗糖30g，NaNO3 2g，K2HPO4 1g，MgSO4∙7 H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4∙7 H2O 0.1g， 水1000mL，pH7.0～7.2。
6. Hayflik 培养基（用于支原体培养）
牛心消化液（或浸出液）1000mL，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，pH7.8～8.0，分 装每瓶70mL，121 ℃湿热灭菌15min， 待冷却至80℃左右， 每70mL中加入马血清20mL，25% 鲜酵母浸出液10mL，15 醋酸铊水溶液2.5mL，青霉素G 钾盐水溶液（20万单位以上） 0.5mL， 以上混合后倾注平板. 注意：醋酸铊是极毒的药品，需特别注意安全操作。 7．麦氏（McCLary）培养基（醋酸钠培养基）
葡萄糖0.1g，KCl 0.18g，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g，琼脂l.5g，蒸馏水l00mL。溶解 后分装试管，1l5℃湿热灭菌15min。 8．葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，K2HPO40.2g，水100mL，pH7.2，1l5℃湿热灭菌20min。用 于V.P．反应和甲基红试验。
9．蛋白胨水培养基（用于吲哚试验）
蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2～7.4，121℃湿热灭菌20min。
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10．糖发酵培养基（用于细菌糖发酵试验）
蛋白胨0.2g，NaCl 0.5g ，K 2HPO4 0.02g， 水100mL， 溴麝香草酚蓝 （1%水溶液）0.3mL， 糖类lg。分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中，调pH至7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量 95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液），加入糖类，分装试管，装量4～5cm 高，并倒 放入一杜氏小管（管口向下，管内充满培养液）。115℃湿热灭菌20min。灭菌时注意适当 延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽以使杜氏小管内不残存气泡。
常用的糖类，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等（后两种糖的用量 常加大为1.5%）。
11. RCM 培养基（强化梭菌培养基） （用于厌氧菌培养）
酵母膏 3g，牛肉膏 l0g，蛋白胨 10g，可溶性淀粉 lg，葡萄糖 5g，半胱氨酸盐酸盐 0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，水l000mL，pH8.5，刃天青3mg/L，l2l℃湿热灭菌30min。 12. TYA 培养基（用于厌氧菌培养）
葡萄糖 40g， 牛肉膏 2g， 酵母膏 2g， 胰蛋白胨 6g， 醋酸铵 3g，KH 2PO4 0.5g，MgSO 4∙7 H2O 0.2g，FeSO4∙7 H2O 0.01g，水1000mL，pH6.5，121℃湿热灭菌30min。 13．玉米醪培养基（用于厌氧菌培养）
玉米粉65g，自来水1000mL，混匀，煮10min 成糊状，自然pH，121℃湿热灭菌30min。 14．中性红培养基（用于厌氧菌培养）
葡萄糖40g，胰蛋白胨6g，酵母膏2g，牛肉膏2g，醋酸铵3g，KH2PO4 5g，中性红0.2g， MgSO4∙7 H2O 0.2g，FeSO4·7 H2O 0.01g，水1000ml，pH6.2，121℃湿热灭菌30min。 15．CaCO3 明胶麦芽汁培养基（用于厌氧菌培养）
麦芽汁（6波美）1000mL，水1000mL，CaCO310g，明胶10g，pH6.8，121℃湿热灭菌 30min。
16．BCG 牛乳培养基（用于乳酸发酵）
（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1mL， 80℃灭菌20min。 （B） 溶液： 酵母膏10g， 水500mL， 琼脂20g，pH6.8 ，121 ℃湿热灭菌20min。 以无菌操作趁热将（A）、（B）溶液混合均匀后倒平板。 17．乳酸菌培养基（用于乳酸发酵）
牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，NaCl 5g，水1000mL，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。
18．酒精发酵培养基（用于酒精发酵）
蔗糖10g，MgSO KH 2PO4 0.5g， 水100mL， 4∙7 H2O 0.5g，NH4NO3 0.5g，20%豆芽汁2mL，自然pH。
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19. 柯索夫培养基（用于钩端螺旋体培养）
优质蛋白胨0.4g，NaCl 0.7g，KCl 0.02g，Na HCO30.01g，CaCl 20.02g，KH2PO4 0.09g， NaH 2PO4 0.48g， 蒸馏水500 mL，无菌兔血清40mL。制法：除兔血清外的其余各成分混 合，加热溶解，调pH 至7.2，121℃湿热灭菌20min，待冷却后，加入无菌兔血清，制成8% 血清溶液，然后分装试管（5～10mL/管），56℃水浴灭活lh后备用。 20．豆芽汁培养基
黄豆芽500g，加水1000mL，煮沸lh，过滤后补足水分，121℃湿热灭菌后存放备用， 此即为50%的豆芽汁， 用于细菌培养：10% 豆芽汁200mL， 葡萄糖 （或蔗糖）50g ， 水800mL， pH7.2～7.4；用于霉菌或酵母菌培养：10%豆芽汁200mL，糖50g，水800mL，自然pH。霉 菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。
21．LB（LuriaBertani） 培养基（细菌培养，常在分子生物学中应用）
双蒸馏水950mL， 胰蛋白胨l0g，NaCl l0g ， 酵母提取物 （bacto yeast extract）5g ， 用lmol/L NaOH （约l mL）调节pH 值至7.0，加双蒸馏水至总体积为1L，121℃湿热灭菌30min。
含氨苄青霉素LB 培养基：待LB 培养基灭菌后冷至50℃左右加入抗生素，至终浓度 为80～100mg/L。
22．复红亚硫酸钠培养基（远藤氏培养基） （用于水体中大肠菌群测定）
蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，琼脂20g，乳糖10g，K2HPO4 0.5g，无水亚硫 酸钠5g，5%碱性复红乙醇溶液20mL，蒸馏水1000mL；制作过程：先将蛋白胨、牛肉浸膏、 酵母浸膏和琼脂加入到900mL水中，加热溶解，再加入K2PO4，溶解后补充水至l000mL， 调pH 至7.2～7.4。随后加入乳糖，混匀溶解后，于115℃湿热灭菌20min。再称取亚硫酸钠 至一无菌空试管中， 用少许无菌水使其溶解， 在水浴中煮沸10min 后， 立即滴加于20mL 5% 碱性复红乙醇溶液中，直至深红色转变为淡粉红色为止。将此混合液全部加入到上述已灭 菌的并仍保持融化状态的培养基中，混匀后立即倒平板，待凝固后存放冰箱备用，若颜色 由淡红变为深红，则不能再用。
23．乳糖蛋白胨半固体培养基（用于水体中大肠菌群测定）
蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，酵母膏5g，乳糖10g，琼脂5g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4， 分装试管（l0mL/管），115℃湿热灭菌20min。
24．乳糖蛋白胨培养液（用于多管发酵法检测水体中大肠菌群）
蛋白胨10g， 牛肉膏3g， 乳糖5g，NaCl 5g ， 蒸馏水l000mL，1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液lmL。 调pH 至7.2，分装试管（l0mL/管），并放入倒置杜氏小管，l15℃湿热灭菌20min。 25．三倍浓乳糖蛋白胨培养液（用于水体中大肠菌群测定）
将乳糖蛋白胨培养液中各营养成分以扩大3 倍加入到l000mL水中，制法同上，分装于 放有倒置杜氏小管的试管中，每管5mL，1l5℃湿热灭菌20min。
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26．伊红美蓝培养基（EMB 培养基）（用于水体中大肠菌群测定和细菌转导） 蛋白胨l0g，乳糖10g，K2HPO4 2g，琼脂25g，2%/伊红Y（曙红）水溶液20mL，0.5% 美蓝（亚甲蓝）水溶液l3mL，pH7.4。制作过程：先将蛋白胨、乳糖、K2HPO4 和琼脂混 匀，加热溶解后，调pH 至7.4，1l5℃湿热灭菌20min，然后加入已分别灭菌的伊红液和美 蓝液，充分混匀，防止产生气泡。待培养基冷却到50℃左右倒平皿。如培养基太热会产生 过多的凝集水， 可在平板凝固后倒置存于冰箱备用。 在细菌转导实验中用半乳糖代替乳糖， 其余成分不变。
27．加倍肉汤培养基（用于细菌转导）
牛肉膏6g，蛋白胨20g，NaCL 10g，水1000mL，pH7.4～7.6。 28．半固体素琼脂（用于细菌转导）
琼脂1g，水100mL，121℃湿热灭菌30min。 29．豆饼斜面培养基（用于产蛋白酶霉菌菌株筛选）
豆饼100g 加水5～6 倍，煮出滤汁100mL，汁内加入KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%， （NH4）2SO4 0.05%，可溶性淀粉2%，pH6，琼脂2%～2.5%。 30．酪素培养基（用于蛋白酶菌株筛选）
分别配制A 液和B 液。
A 液：称取Na2HPO4∙7 H2O 1.07g。干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。 B 液：称取 KH2PO4 0.36g，加水溶解。
A、B 液混合后，加入酪素水解液0.3 mL，加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1000mL。 酪素水解液的配制：1g 酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶 25mL 加水至100mL，30℃水解lh。用于配制培养基时，其用量为1000mL 培养基中加入 100mL 以上水解液。
31．细菌基本培养基（用于筛选营养缺陷型）
Na2HPO4∙7 H2O 1g，MgSO 7 H 2O 0.2g，葡萄糖5g，NaCl 5g，K2HPO4 lg， 水l000mL， 4·pH7.0，1l5℃湿热灭菌30min。
32. YEPD培养基（用于酵母原生质体融合）
酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，115℃湿热灭菌20min。 33. YEPD高渗培养基（用于酵母原生质体融合）
在YEPD培养基中加入0.6mol/L的NaCL，3%琼脂。 34. YNB 基本培养基（用于酵母原生质体融合）
0.67%酵母氮碱基（YNB，不含氨基酸，Difco），2%葡萄糖，3%琼脂，pH6.2。另一 配方为： 葡萄糖10g（NH4） 4 1g，K 2HPO4 0.125g，KHPO KI 0.0001g ，MgSO 7 2SO4 0.875g，4·H2O 0.5g，CaCl2∙2 H2O 0.lg，NaCl0.1g，维量元素母液lmL，维生素母液lmL（母液均按常
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规配制），水1000mL，pH5.8～6.0。
35. YNB 高渗基本培养基（用于原生质体融合）
在YNB基本培养基中加入6 mol/LNaCl。
36．酚红半固体柱状培养基（用于检查氧与菌生长的关系）
蛋白胨1g，葡萄糖10g，玉米浆10g，琼脂7g，水1000mL，pH7.2。在调好pH 后，加 入1.6%酚红溶液数滴，至培养基变为深红色，分装于大试管中，装量约为试管高度的1/2， 1l5℃灭菌20min。细菌在此培养基中利用葡萄糖生长产酸，使酚红从红色变成黄色，在不 同部位生长的细菌，可使培养基的相应部位颜色改变。但注意培养时间太长，酸可扩散以 致不能正确判断结果。
以上各种培养基均可配制成固体或半固体状态，只需改变琼脂用量即可，前者为 1.5%～2.0%，后者为0.3%～0.8%。
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附录3 实验用染色液及试剂的配制
一、实验用染色液的配制
1．黑色素液
水溶性黑素10g，蒸馏水100mL，甲醛（福尔马林）0.5mL。可用作荚膜的背景染色。 2．墨汁染色液
国产绘图墨汁40mL，甘油2mL，液体石炭酸2mL。先将墨汁用多层纱布过滤，加甘油 混匀后，水浴加热，再加石炭酸搅匀，冷却后备用。用作荚膜的背景染色。 3．吕氏（Loeffier）美蓝染色液
A 液：美蓝（methylene blue， 又名甲烯蓝）0.3g， 95%乙醇30mL; B 液：0.0l% KOH l00mL。
混合A 液和B 液即成，用于细菌单染色，可长期保存。根据需要可配制成稀释美蓝 液，按1：10 或1：100 稀释均可。 4．革兰氏染色液
（1）结晶紫（crystal violet）液：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g 溶于20mL95%乙醇 中）20mL，
1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h 后过滤即成。 此液不易保存， 如有沉淀出现， 需重新配制。
（2）卢戈（Lugol）氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于少量 蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300mL即成。配成后贮于棕色瓶内备 用，如变为浅黄色即不能使用。
（3）95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下（4）或（5）的其中一项复染即可。 （4）稀释石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液（碱性复红1g，95%乙醇l0mL，5% 石炭酸90mL混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液），取石炭酸复红饱和液l0mL加蒸馏水 90mL即成。
（5）番红溶液：番红O（safranine，又称沙黄O）2.5g， 95%乙醇100mL，溶解后可 贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL 与80mL 蒸馏水混匀即可。
以上染液配合使用，可区分出革兰氏染色阳性（G+）或阴性（G）细菌，G被染成 蓝紫色，G+被染成淡红色。 5. 鞭毛染色液
A 液：丹宁酸5.0g，FeCl3 1.5g，15%甲醛（福尔马林）2.0mL，l%NaOH 1.0mL，蒸馏 水l00mL;
B 液：AgNO3 2.0g，蒸馏水100mL。
待AgNO3 溶解后，取出l0mL 备用，向其余的90mLAgNO3 中滴加NH4OH，即可形成 很厚的沉淀， 继续滴加NH4OH 至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止， 再将备用的AgNO3 慢 慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入AgNO3，直到
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摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止，如雾重，说明银盐沉淀出，不宜再用。通常 在配制当天便用，次日效果欠佳，第3天则不能使用。 6. 0.5%沙黄（Safranine）液
2.5%沙黄乙醇液20mL，蒸馏水80mL。将2.5%沙黄乙醇液作为母液保存于不透气的棕 色瓶中，使用时再稀释。 7. 5%孔雀绿水溶液
孔雀绿5.0g，蒸馏水100mL。 8. 0.05%碱性复红
碱性复红0.05g，95%乙醇100mL。 9．齐氏（Ziehl）石炭酸复红液
碱性复红0.3g溶于95%乙醇l0mL中为A 液：0.01%KOH 溶液l00mL 为B 液。混合A、 B 液即成。
10．姬姆萨（Giemsa）染液
（1）贮存液：称取姬姆萨粉0.5g，甘油33mL，甲醇33mL。先将姬姆萨粉研细，再逐 滴加入甘油，继续研磨，最后加入甲醇，在56℃放置1～24h 后即可使用。
（2）应用液（临用时配制）：取1mL 贮存液加19mL pH7.4 磷酸缓冲液即成。亦可 取贮存液：甲醇=1：4 的比例配制成染色液。 11．乳酸石炭酸棉蓝染色液（用于真菌固定和染色）
石炭酸（结晶酚）20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶 于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。滴少量染液于真菌涂片上， 加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。
染色后的标本可用树脂封固，能长期保存。 12. 1%瑞氏（Wright’s）染色液
称取瑞氏染色粉6g，放研钵内磨细，不断滴加甲醇（共600mL）并继续研磨使溶解。 经过滤后染液须贮存一年以上才可使用，保存时间愈入，则染色色泽愈佳。 13．阿氏（Albert） 异染粒染色液
A 液：甲苯胺蓝（toluidine blue）0.15g，孔雀绿0.2g，冰醋酸lmL，95%乙醇2mL，蒸 馏水100mL；B 液：碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。
先用A液染色1min，倾去A液后，用B液冲去A液，并染1min。异染粒呈黑色，其他部 分为暗绿或浅绿。
二、实验用试剂的配制
l．乳酸苯酚固定液
乳酸10g， 结晶苯酚10g， 甘油20g， 蒸馏水10 mL。 2. 1.6%溴甲酚紫
溴甲酚紫1.6g 溶于100mL 乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。用作培养基指示剂时，
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每1000mL 培养基中加入lmL 1.6%溴甲酚紫即可。 3. V.P.试剂
CuSO4 1g，蒸馏水l0mL，浓氨水40mL，10% NaOH 950mL。先将CuSO4溶于蒸馏水中， 然后加浓氨水，最后加入10%NaOH。 4. 0.02%甲基红试剂
甲基红0.1g，95% 乙醇760mL，蒸馏水100mL。 5. 吲哚反应试剂
对二甲基氨基苯甲醛8g， 95%乙醇760mL，浓HCl160mL。 6. Alsever’s 血细胞保存液
葡萄糖2.05g，柠橡酸钠0.8g， NaCl 0.42g，蒸馏水l00mL。
以上成分混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调节pH 6.1，分装于三角瓶中（30～ 50mL/瓶）， 113℃湿热灭菌15min，备用。 7. Hank’s 液
（l）贮存液A 液：（I）NaCl 80g，KCl 4g，MgSO4∙7 H2O 1g，MgCl2∙6 H2O 1g，用双 蒸馏水定容至450mL： （II）CaCl2 1.4g （或CaCl2·2 H2O 1.85g） 用双蒸馏水定容至50mL。 将I 和II 液混合，加氯仿1mL 即成A 液。
（2）贮存液B 液：Na2HPO4∙12 H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g，酚红0.2g，葡萄糖10g，用 双蒸馏水定容至500mL，然后加氯仿1mL，酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一 溶解。
（3）应用液：取上述贮存液的A 和B 液各25mL，加双蒸馏水定容至450mL，113℃ 湿热灭菌20min。置4℃下保存。使用前用无菌的3% NaHCO3 调至所需pH。
注意：药品必须全部用A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸馏水溶解，待前一 种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。
（4）10%小牛血清的Hank’s 液：小牛血清必须先经56℃、30min 灭活后才可使用， 应小瓶分装保存，长期备用。用时按10%用量加至应用液中。 8. 0.1 mol/LCaCl2溶液
双蒸馏水900mL，CaCl2 11 g，定容至l L，可用孔径为0.22μm的滤器过滤除菌或12l℃ 湿热灭菌20 min。 9. 0.05 mol/L CaCl2溶液
双蒸馏水900mL，CaCl2 5.5 g，定容至l L，可用孔径为0.22μm的滤器过滤除菌或12l℃ 湿热灭菌20min。
10. α淀粉酶活力测定试剂
（1）碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，加水溶解定容至500mL。 （2）标准稀碘液：取碘原液15mL，加碘化钾8g，定容至500mL。 （3）比色稀碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，定容至500mL。
（4）2%可溶性淀粉：称取干燥可溶性淀粉2g，先以少许蒸馏水混合均匀，再徐徐倾
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入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2min，待冷却后定容至100 mL（此液当天配制使用）。
（5）标准糊精液：称取分析纯糊精0.3g，用少许蒸馏水混匀后倾入400mL 水中，冷 却后定容至500mL，加入几滴甲苯试剂防腐，冰箱保存。 11. pH6.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液
称取Na2HPO4∙12 H2O 45.23g， 柠檬酸 （C6H8O7∙H2O） 8.07g， 加蒸馏水定容至1000mL。 12. 0.l mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）
称取Na2HPO4∙12 H2O 35.82g，溶于1000 mL 蒸馏水中，为A 液： 称取NaH2PO4·2 H2O 15.605 g，溶于l000 mL 蒸馏水中，为B 液。取A 液61 mL，B 液39 mL，可得到100 mL 0.l mol/L pH7.0 的磷酸缓冲液。 13．测定乳酸的试剂
（l）pH9.0 缓冲液： 在300mL容量瓶中加入甘氨酸11.4g，24%NaOH 2mL ， 加275mL 蒸 馏水。
（2）NAD 溶液：NAD 600mg 溶于20mL 蒸馏水中。 （3）L（+）LDH：加5mg L（+）LDH 于lmL 蒸馏水中。 （4）D（）LDH：加2mg D（）LDH 于lmL 蒸馏水中。 14. Taq 缓冲液（10×）
TrisHCl （pH8.4） 100mmol/L，KCl 500mmol/L，MgCl2 15mmol/L，BSA （牛血清 清蛋白） 或明胶lmg/mL。 15. dNTP 混合液
dATP 50mmol/L，dCTP 50mmol/L，dGTP 50mmol/L，dTTP 50mmol/L。 16. 1%琼脂糖
琼脂糖lg，TAE100mL，100℃融化后待凉至40℃倒胶，胶厚度约0.4～0.6。
17. TAE
Tris 碱4.84mL，冰乙酸1.l4mL，0.5mol/L pH8.0 的EDTA Na2∙2 H2O （乙二胺四乙 酸钠盐）2mL。 18. EDTA
0.5mol/L EDTA（pH8.0）在800mL 蒸馏水中加186.lg EDTA，剧烈搅拌，用NaOH调 pH 至8.0（约20g 颗粒），定容至lL，分装后121℃湿热灭菌备用。 19．硝酸盐还原试剂
（1）格里斯氏（Griess）试剂
A 液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150mL；
B 液：α萘胺0.1g，蒸馏水20mL， 稀醋酸（10%左右）150 mL。 （2）二苯胺试剂：二苯胺0.5g 溶于l00mL 浓硫酸中，用20 mL 蒸馏水稀释。 在培养液中滴加A、B 液后溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等表示有亚硝 酸盐还原，反应为阳性，如无色出现则可加1～2 滴二苯胺试剂：如溶液呈蓝色则表示培 养液中仍存在有硝酸盐，从而证实该菌无硝酸盐还原作用：如溶液不呈蓝色，则表示形成 的亚硝酸盐已进一步还原成其他物质，故硝酸盐还原反应仍为阳性。
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