原理
血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH- CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似,故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在0nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系,经与同样处理的蛋白质标准液比较,即可求得蛋白质含量。 器材 分光光度计 试剂
1.6mol/L NaOH溶液称取NaOH240g,溶于新鲜制备的蒸馏水约800ml中,定容至1L,贮于有盖塑料瓶中。
2.双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶(CuSO4·5H2O)3g溶于新鲜制备的蒸馏水500ml中,加入酒石酸钾钠(NaKC4H406·4H2O,用以结合Cu2+,防止CuO在碱性条件下沉淀)9g和KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析)5g。待完全溶解后,在搅拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml,并用蒸馏水定容至1L,置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年,若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。
3.60~70g/L蛋白质标准液可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。 操作
取试管3支,混匀,置25℃30min或37℃ 10min,在波长0mm处比色,用空白管调零,测各管吸光度。 参考范围
正常成人参考范围为60~80g/L。长久卧床者约低3~5g/L,60岁以上约低2g/L,新生儿总蛋白浓度较低,随后逐月缓慢上升,大约1年后达成人水平。 注意事项
1.黄疸血清,严重溶血,葡萄糖,酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰,故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高,可影响测定的准确度。
2.高脂血症混浊血清会干扰比色,可采用下述方法消除:取2支带塞试管或离心管,各加待测血清0.1ml,再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml,塞紧并颠倒混匀10次后离心,倾去上清液,将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂,再进行与上述相同的其他操作和计算。 评价
1.双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系,与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系,各种蛋白质的显色程度基本相同。
2.本法重复性好,RCV为4%,CCV为3.9%;线性范围为0~140g/L;本法干扰少,并且大多可以避免;使用单一的稳定试剂,操作简便、快速,既适于手工操作,也便于自动化分析,已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。
3.唯一的缺点是灵敏度较低,比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.2~1.7g/L,这相当于70g/L的血清3~24μl,已能满足临床生化检验的需要。 4.本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。
5.临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合法、BCA法和免疫比浊法。
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