胡萝卜的愈伤组织培养论文

摘 要

本试验以胡萝卜的形成层组织为试验材料，材料经消毒灭菌，无菌接种在附加植物激素1.0mg/L 2,4-D的MS诱导培养基的三角瓶中, 培养温度28-30℃，避光培养30天左右，即可诱导产生胡萝卜的愈伤组织。 关键词：胡萝卜 组织培养 愈伤组织

ABSTRACT

In this experiment, we use carrot’s formation layer as materials. After disinfection and sterilization, the materials are inoculated in MS induction medium with additional plant hormones 1.0mg / L 2,4-D. Culture the materials with temperature of 28-30 ℃ and about 30 days in dark, then carrot callus can be induced. Key words: carrot tissue culture callus

前 言

在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。在单倍体育种中，也可由花粉产生的

愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。

在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:1来诱导植物材料愈伤组织的形成。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。

胡萝卜(Daucus carota L.)是全球性的蔬菜作物之一,种植面积非常广泛。2007年,我国胡萝卜的栽培面积已达到49.3万公顷,约占全世界栽培面积的40.9%,是世界第一胡萝卜生产国。随着国内外对胡萝卜产量及质量需求的提高,对于胡萝卜育种研究也提出了更高的要求。 我国胡萝卜育种研究相对滞后,目前生产上仍以80年代的黑田系列为主。市场上品种单一,品质退化。因此,培育出适合我国规模化生产的高产、优质、抗病胡萝卜新品种显得尤为重要。但常规育种费时费力,为了解决这一问题,加快基因纯合,缩短育种时间,胡萝卜的组织培养便成为一种很好的方法，本试验意在探究胡萝卜愈伤组织的形成过程，初步探究愈伤组织形成的培养条件，了解胡萝卜的愈伤组织形态特点，生理特性。学会植物组织培养的灭菌，接种以及培养技术，为以后的进一步研究打好基础。

本 论

1材料和方法 1.1材料

胡萝卜直根，附加植物激素的MS诱导培养基。

1.2方法

以胡萝卜直根形成层为外植体诱导：用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒2min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡10min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1.5mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长4mm,宽2.5mm,高1.5mm的小长块,接种在附加植物激素1.0mg/L 2,4-D的MS诱导培养基的三角瓶中, 培养温度28-30℃，避光培养30天左右。观察胡萝卜愈伤组织的形态特征，计算染菌率，与伤组织诱导形成率，观察有无褐化现象出现。

2结果与讨论

我们一组总共接种了四瓶组织，但由于其中有三瓶培养基再配置过程中可能由于琼脂浓度不够导致培养基没有固化呈粘稠的胶质状态，当接种材料之后，材料完全浸没于培养基中，植物材料因缺氧而死，导致此三瓶材料没有结果，但也没有发现培养基染菌现象，说明接种过程并没有引入杂菌，或者是培养基无法满足细菌生长所需营养而使细菌无法生长。在唯一的一瓶固化培养基中，接种了7块材料，其中有2块发生染菌现象，一块有稍微褐化现象，其余4块正常，初步分析染菌原认为由于胡萝卜材料灭菌面积比较大，材料灭菌不彻底，导致接种材料本身带菌，接种后发生染菌。褐化现象则是由于材料产生酚类物质被氧化而产生褐色物质。观察形成的愈伤组织发现，组织呈橘黄色，色泽较暗，质地较硬，形状不规则，分散度差。

3试验心得

这次试验总体来说比较失败，这其中有非自身方面的原因，但与我们的操作也有一定关系。通过此次试验，充分认识到植物组织培养过程中无菌条件的重要性，由于菌类一般比外植体生长周期要短得多，一旦染菌将导致试验材料的死亡，灭菌的难以与外植体的大小呈正相关性，材料越大，灭菌越难。在试验过程中不但要保证试验材料的灭菌彻底，而且在接种过程中也要严格遵照试验要求，避免引入杂菌。