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还原型和氧化型谷胱甘肽在磁性Fe_3O_4纳米粒子上的吸附组装

来源：爱站旅游

・184・化学通报　2006年第3期　　　　　　　　　　http:ΠΠwww.hxtb.org

还原型和氧化型谷胱甘肽在磁性Fe3O4纳米粒子上的吸附组装

王青　姜继森　杨勇

(华东师范大学物理系纳米功能材料与器件应用研究中心　上海　200062)

摘　要　研究了Fe3O4磁性纳米粒子在水溶液中对还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的吸附。分别测定了两种物质在不同温度下的吸附等温线,比较了研究结果,并用Freundlich吸附等温式对数据进行拟合,根据公式计算出相关的吸附热力学函数值,研究了碳化二亚胺含量和pH对吸附结果的影响,并从吸附量和脱附实验结果探讨了其可能的吸附机理。结果表明,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽在Fe3O4表面的吸附是不可逆的,加入强电解质基本不能够脱附,两者间形成了部分共价键。

关键词　Fe3O4　纳米粒子　还原型和氧化型谷胱甘肽　吸附　脱附　热力学

AdsorptionofGlutathioneReducedandOxidizedonMagnetiteFe3O4Nanoparticles

WangQing,JiangJisen,YangYong

(DepartmentofPhysics,CenterforFunctionalNanomaterialsandDevices,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200062)

Abstract　Theadsorptionofglutathionereducedandoxidizedonmagnetitewasstudied,andadsorptionisothermsofglutathionereducedandoxidizedonFe3O4nanoparticlesatdifferenttemperatureweredeterminedandtheiramountsadsorbedwerecomparedindividually.ResultsshowedthatFreundlichequationiswellfittedfortheadsorptionofglutathionereducedandoxidizedonFe3O4nanoparticles,theadsorptionthermodynamicsparameterswereobtained,andtheadsorptionmechanismwerediscussed.IrreversibleadsorptionofglutathionereducedandoxidizedwasobservedsinceitcannotbeerasedinKNO3andHClsolutions.Itwassuggestedthatchemicalinteractionbondsplayanimportantroleintheadsorption.

Keywords　Magnetite,Nanoparticle,Glutathionereducedandoxidized,Adsorption,Desorption,Thermodynamics

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽,半胱氨酸上的巯基为其活性基团,但巯

基容易引起两个分子谷胱甘肽的偶联,因此谷胱甘肽有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式(其结构如图1所示),在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数,谷胱甘肽还原酶能催化两型间的互变。谷胱甘肽具有多种重要的作用,如抗病毒作用、抗肿瘤作用、保护肝脏作用等

OH2NCHCH2CH2

COOH

OOH2NCHCH2CH2

COOH

[1]

。

O…

NHCHCNHCH2COOH…

CH2SH…

NHCHCNHCH2COOH…

CH2

SGSH

H2NCHCH2CH2

COOH

OCCH2O…NHCHCNHCH2COOH…

GSSG

图1　GSH和GSSG的化学结构

Fig.1　ThechemicalstructuresofGSHandGSSG

王青　男,27岁,硕士生,现从事纳米材料制备及其性质研究。　3联系人,E2mail:jsjiang@phy.ecnu.edu.cn上海市科委纳米专项资金资助(0352nm113)

2005-06-26收稿,2005-11-15接受

http:ΠΠwww.hxtb.org　　　　　　　　　　化学通报　2006年第3期・185・

　　磁性无机纳米粒子(如γ-Fe2O3、Fe3O4等)既有常见无机纳米粒子的物理化学特性,又有磁性,在医疗医药、生物化学及工业应用等领域显示出广泛的应用前景,成为一个研究热点。

[5～7]

(由10～20个氨基酸组成)与纳米颗粒相结合以开发其在肿瘤诊最近,将特异性强的导向肽断、治疗及靶向给药中应用的研究受到重视。Akerman等研究了对肺癌具有特异性的导向肽与ZnS包

覆的CdSe纳米颗粒相偶联的复合体在动物体内的定向,其结果表明导向肽与纳米颗粒的结合将在疾病的诊断、治疗及靶向给药方面有广泛的应用前景。将导向肽与磁性纳米颗粒相结合,能发挥双导向(磁导向和生物导向)的功能。因此,研究肽在磁性纳米颗粒上的结合组装有很大的实际应用价值。但由于十几个氨基酸组成的肽,其化学合成步骤繁琐、制备过程要求苛刻、价格高,为此笔者选择了一种常见、普遍而在生物学上又有重要应用和研究价值的小分子肽———谷胱甘肽作为替代物进行研究。研究谷胱甘肽在磁性粒子上的吸附组装的行为,对了解由更多氨基酸组成的具有导向功能的肽在磁性粒子上的吸附组装行为有重要的指导意义。本文通过化学共沉淀法合成了磁性载体———纳米Fe3O4,研究了谷胱甘肽在Fe3O4磁性粒子上的直接吸附组装行为及相关热力学函数,并进行了表征,考察了修饰活化试剂二环己基碳化二亚胺和pH对吸附组装的影响,简单讨论了吸附的机理。

[8]

[2～4]

1　实验部分

111　仪器与试剂

UnicoUV-2802S型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);PHS-2C型酸度计(上海伟业

仪器厂);THZ-恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂);F-GZX101-1BSⅡ电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽(上海蓝生科技发展有限公司);2,9-二甲基-1,102菲　啉(简称新铜试剂,中国上海三爱思试剂公司);二环己基碳化二亚胺(国药集团化学试剂有限公司);磷酸、乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸(中国医药集团上海化学试剂公司)均为分析纯。

112　纳米Fe3O4的制备Fe3O4采用共沉淀法制得,即在25℃、氮气保护和快速磁搅拌的条件下向亚铁盐和铁盐混合溶液

[9]

中滴加011molΠL的氢氧化钠溶液,直至pH为11,继续搅拌2h,在80℃下陈化2h,经洗涤和磁分离直至中性,过滤抽干后在真空干燥箱内80℃干燥24h,研磨备用。

113　谷胱甘肽浓度的测试方法

谷胱甘肽测定采用紫外分光光度法

[10]

,在新铜试剂-谷胱甘肽-乙醇体系中进行显色反应后测定。

先准确称取011gGSH,以水溶解至1000mL得到011mgΠmL的标准溶液。称取6215mgCuSO4・5H2O,以20～30mL水溶解,再称取13518mg新铜试剂,用8mL无水乙醇溶解,二者充分混合后以水定容至250mL,作为显色剂。于25mL容量瓶中,加入适量的谷胱甘肽标准溶液、3mL显色剂和7mL无水乙醇,

摇匀,以水定容,稳定30min。用1cm比色皿,以试剂空白作参比,于456nm处测定试剂吸光度值,制作标准曲线。氧化型谷胱甘肽测试时加入011gFeSO4・7H2O,将其还原成GSH后按照还原型谷胱甘肽的测试方法测试。

114　吸附实验

在一系列50mL磨口锥形瓶中分别加入50mgFe3O4和25mL不同浓度的谷胱甘肽溶液,分别在20、40、60℃温度下以220rΠmin的转速振荡24h(事先吸附平衡实验证实24h已达到充分的平衡,谷胱甘肽浓度不再发生变化),过滤,按照上述方法处理后用紫外分光光度计在456nm处测定试剂的吸光度值,根

据标准曲线得出吸附后溶液的平衡浓度,由以下公式计算出Fe3O4对还原性和氧化型谷胱甘肽的吸附量。吸附量计算公式为:

V(C0-Ce)

　　式中q为吸附量(mgΠg),V为被吸附溶液的体积(L),C0为吸附前的溶液浓度(mgΠL),Ce为平衡浓度(mgΠL),m为Fe3O4的用量(g)。

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115　碳化二亚胺对吸附的影响

在一系列50mL磨口锥形瓶中加入50mgFe3O4和25mL浓度1mgΠmL的还原性或氧化型谷胱甘肽,再加入不同质量的碳化二亚胺配制成碳化二亚胺含量不同的混合溶液,然后一同置于恒温振荡器中,在

20℃下以220rΠmin的转速振荡24h至平衡,测定各自的吸附平衡浓度,计算相应的吸附量,作图分析碳化二亚胺含量对谷胱甘肽吸附的影响。

116　脱附实验

为了研究谷胱甘肽的吸附性质和规律,进行了脱附实验。在50mL磨口锥形瓶中预先加入吸附谷胱甘肽后的Fe3O4粉体125mg,加入25mL011molΠL的KNO3溶液,振荡2h,过滤,再回收滤纸上的Fe3O4至50mL磨口锥形瓶中,再加入25mL011molΠL的KNO3溶液,振荡2h后过滤,再同样在回收的Fe3O4中加入25mL0105molΠL的HCl,振荡2h后过滤。上述所有振荡都在转速220r/min、温度20℃下进

[11]

行。分析各次滤液中谷胱甘肽的浓度,计算各次相应洗脱量。

2　结果与讨论

211　Fe3O4纳米微粒的形貌和结构

图2为Fe3O4纳米微粒的TEM照片,从照片中可看出,由化学共沉淀方法制备的Fe3O4纳米微粒主要为球形结构,小部分粒子近似呈立方体形,粒子的直径在7～18nm之间,平均直径约为11nm。BET测

试得到的粒子的比表面积为11611mΠg,计算得到的平均粒径为1116nm,与TEM数据相当。

图2　Fe3O4纳米微粒的TEM图

Fig.2　TheTEMgraphofFe3O4nanoparticle

212　吸附等温线

不同温度下Fe3O4吸附还原型和氧化型谷胱甘肽的等温线(经测定pH分别为6179、6163)如图3和图4所示。由图可见,Fe3O4对谷胱甘肽的吸附均随温度的升高吸附量减小,表明Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附是放热过程,温度低时有利于谷胱甘肽的吸附。

图3　还原型谷胱甘肽在Fe3O4上的吸附等温线

Fig.3　AdsorptionisothermsofglutathionereducedonFe3O4

图4　氧化型谷胱甘肽在Fe3O4上的吸附等温线

Fig.4　AdsorptionisothermsofglutathioneoxidizedonFe3O4

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　　图5给出了在相同温度293K、相同初始浓度条件下还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附等温线。由图可见,两者吸附曲线的形状很相像,都是随浓度的增加吸附量增大,增加到一定浓度时吸附达到饱和,还原型和氧化型谷胱甘肽饱和吸附量分别为69196mgΠg和79167mgΠg,可见Fe3O4对氧化型谷胱甘肽的的吸附量大于还原型谷胱甘肽。还原型和氧化型谷胱甘肽结构(如图1所示)相差很大,氧化型谷胱甘肽分子是由两条还原型谷胱甘肽分子链偶联而成。谷胱甘肽分子能够和Fe3O4纳米粒子发生吸附作用,主要依赖谷胱甘肽分子的羧基和Fe3O4粒子表面羟基之间的静电和氢键以及部分化学成键作用,每个氧化型谷胱甘肽分子的上的羧基个数比还原型谷胱甘肽分子上的多,因此在相同情况下,Fe3O4纳米粒子和氧化型谷胱甘肽分子间作用力比较大,Fe3O4磁性纳米粒子表面吸附达到饱和时,它对氧化型谷胱甘肽的吸附量就大于对还原型谷胱甘肽的吸附量。

图5　293K时还原型和氧化型谷胱甘肽在Fe3O4上的吸附等温线

Fig.5　AdsorptionisothermsofglutathionereducedandoxidizedonFe3O4at293K

从图6可以看出,当溶液中碳化二亚胺含量小于0.5mgΠmL时,还原型和氧化型谷胱甘肽在粒子上

的吸附量随着碳化二亚胺浓度的增加迅速增加,但当溶液中碳化二亚胺含量大于015mgΠmL时,随着碳化二亚胺浓度的增加,吸附量几乎没有变化。碳化二亚胺在反应过程中起到修饰谷胱甘肽上的羧基的作用,使它活化而能更容易和Fe3O4粒子上的羟基发生反应而被固定在粒子表面上。碳化二亚胺开始起到的作用很大,但随加入量的增加,达到015mgΠmL时,吸附量不再增加,可能此时谷胱甘肽在粒子上的吸附已到达饱和,Fe3O4粒子表面的活性位点已被占满,而继续增加碳化二亚胺的浓度不能使吸附量再增大。因此碳化二亚胺的最佳加入量为015mgΠmL。

图6　碳化二亚胺含量对谷胱甘肽吸附的影响

Fig.6　Theeffectofconcentrationofcarbodiimideonglutathioneadsorption

图7和图8给出了在相同温度293K、相同初始浓度(1mgΠmL)条件下还原型和氧化型谷胱甘肽在不同pH时的吸附曲线。由图可见,两者吸附曲线的形状很相似,pH在218～610范围内时吸附量较大,且变化不大;pH大于7时,吸附量下降很快。根据电离常数,计算得到还原型和氧化型谷胱甘肽的等电点

[12]

分别为2127和2119,而测定得到Fe3O4的等电点为6153。

因此在pH218～6范围内时,还原型和氧化型谷胱甘肽都带负电,而Fe3O4表面带正电,Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽有较强的静电作用,此时可发生电性吸附,吸附量变大;在pH大于7时,还原型

・188・化学通报　2006年第3期　　　　　　　　　　http:ΠΠwww.hxtb.org

图7　不同pH时还原型谷胱甘肽在Fe3O4上的吸附量

Fig.7　Adsorptionofglutathionereducedon

Fe3O4atdifferentpH

图8　不同pH时氧化型谷胱甘肽在Fe3O4上的吸附量

Fig.8　Adsorptionofglutathioneoxidizedon

Fe3O4atdifferentpH

和氧化型谷胱甘肽及Fe3O4表面都带负电,且pH越大,带负电越多,两者间的电性排斥力也越强,此时不可能发生静电吸附,因此吸附量变小。但此情况下还是有一定的吸附量,证明除了静电吸附作用外,

还有其它的吸附作用。

根据Freundlich等温方程:

lnqe=lnKF+(lnCe)Πn式中:qe为平衡吸附量(mgΠg);Ce为吸附平衡浓度(mgΠL);KF、n为常数,KF可用来衡量吸附能力的相对大小。用Freundlich吸附等温式对以上图中数据进行拟合,结果见表1。

表1　谷胱甘肽在Fe3O4上吸附Freundlich等温方程的参数

Tab.1　FreundlichparametresofadsorptionisothermforadsorptionofglutathioneonFe3O4

吸附质还原型谷胱甘肽

温度ΠK

Freundlich等温方程lnqe=lnKF+(lnCe)Πn

相关系数r

019920019982019916019910019983019968

293313333

013278012400011868018687017887016878

117898113867112358214565212301118968

氧化型谷胱甘肽293313333

　　在表1中,Freundlich公式拟合的相关系数r都达到0199,说明Freundlich公式能很好地适用于所研究的体系。在Freundlich公式中,KF可用于表示吸附能力的相对大小,常数n与吸附推动力的强弱有关,KF值越大,吸附能力越大;n值越大,吸附强度越大。不同温度下,Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附随着温度的升高,KF值下降,表明降低温度有利于吸附;常数n也随着温度的升高而降低,也表明吸附强度随着温度的升高而降低。因此,为增加Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附量和提高吸附强度应该选择在较低的温度下进行。

213　吸附热力学

ΔH、ΔS的数值来解释,根据文献[13]和[14]可得出热力吸附量规律可以通过热力学函数ΔG、学函数计算式:

ΔG=-RTΔG

∫X

dX=-nRT

lnCe=-lnK0+

ΔH

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ΔS=

ΔH-ΔGT

　　Ce是吸附质的平衡浓度,K0是常数,n是Freundlich方程中的常数。根据吸附实验数据计算所得到ΔG、ΔS值列于表2中。的ΔH、

表2　谷胱甘肽在Fe3O4上吸附热力学数值

Tab.2　ThermodynamicsdataforadsorptionofglutathioneonFe3O4

吸附质还原型谷胱甘肽

(mgΠqeΠg)506070

ΔHΠ(kJΠmol)

293K

-9188-7166-4183-16156-14128-12132

-5198-4136

ΔGΠ(kJΠmol)

313K

333K

293K

ΔSΠ(J・mol-1・K-1)

313K-20103-13103-3190-36170-27109-20183

333K-19139-12178-4123-34111-27127-21139

-18184

-3161

-3142

-11133-1161-38186

-5180

-5125

-26151-12130

氧化型谷胱甘肽506070

由表2可见,Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附均是自发的放热过程(ΔG<0,ΔH<0),并且氧化型谷胱甘肽ΔG的绝对值大于还原型谷胱甘肽ΔG的绝对值,表明Fe3O4对氧化型谷胱甘肽的吸附有更大的推动力,这与表1KF值所表示的吸附能力顺序相一致。之所以Fe3O4对氧化型谷胱甘肽的吸附比较容易,是因为氧化型谷胱甘肽上有四个游离的羧基,而还原型谷胱甘肽上只有两个游离的羧基,羧基越多,和Fe3O4表面发生静电和氢键吸引作用也越强,吸附也越牢固和容易。还原型和氧化型ΔH<0、ΔS<0,表明其谷胱甘肽的吸附焓变ΔH<0,表明吸附为放热过程,降低温度有利于吸附。

吸附为焓驱动的放热熵减过程。另外,ΔG反映了一个反应推动力的大小,ΔG越负,表明推动力越大,在吸附过程中体现出来就是吸附量也越大。表2中还原型和氧化型谷胱甘肽在磁性纳米粒子上的ΔG都为负值,绝对值随着温度的上升而下降,且还原型谷胱甘肽ΔG绝对值小于氧化型谷胱甘肽ΔG绝对值。可以从上述热力学数据推出还原型和氧化型谷胱甘肽吸附量均随着温度的上升而下降,且氧化型谷胱甘肽吸附量大于还原性谷胱甘肽吸附量的结论,这与实验结果是相一致的。

214　脱附结果

脱附实验得到的结果如表3所示。从表3可以看出,在用011molΠLKNO3浸泡4h后,还原型和氧化型谷胱甘肽只有很少量从Fe3O4表面洗脱,再用0105molΠLHCl浸泡2h后,在滤液中也只检出少量还原型和氧化型谷胱甘肽,在先后用011molΠLKNO3和0105molΠLHCl脱附后,也各自总共只有16%的还原型和氧化型谷胱甘肽被脱附,绝大部分原先吸附在Fe3O4上的还原型和氧化型谷胱甘肽仍然牢固的吸附着。从以上分析可知,还原型和氧化型谷胱甘肽在Fe3O4表面上的吸附是不可逆的,吸附后较难脱附。

表3　谷胱甘肽在KNO3和HCl溶液中的脱附

Tab.3　ThedesorptionofglutathioneinKNO3andHClsolutions

(mgΠ脱附量Πg)

样品(mgΠ脱附前吸附量Πg)011molΠLKNO30105molΠLHCl

2h51864198

(mgΠ脱附后残余量Πg)

前2h

GSHGSSG

6919579164

31204176

后2h

21163128

5817366162

+-　　脱附实验中,当把吸附谷胱甘肽后的Fe3O4粉体加入到强电解质KNO3溶液中,K和NO3使得谷

胱甘肽离子和Fe3O4纳米粒子间的氢键和静电吸引作用被破坏,应能使谷胱甘肽从Fe3O4表面脱附,而事实上电解质KNO3对吸附在Fe3O4表面的谷胱甘肽基本不起作用,谷胱甘肽仍能够大量吸附在粒子表面上,说明谷胱甘肽和Fe3O4粒子表面羟基可能形成了部分共价键,但仍有部分是凭借物理作用。另

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[15]

外,盐酸的加入也同样不能将它脱附,进一步说明形成的部分共价键稳定性特别好。Aria等

半胱氨酸对氢氧化铁的分解还原动力学和机理研究中已证实了铁离子可以和带巯基的物质形成稳定的共价键结构。

所作的

215　磁性能测试

图9为吸附前后样品室温下所测的磁化曲线,从图上可知Fe3O4和吸附还原型或氧化型谷胱甘肽后的Fe3O4粉体均为超顺磁性粒子,其比饱和磁化强度Ms分别为66180emuΠg、55128emuΠg和52117emuΠg。

相对于块体材料(饱和磁化度为92emuΠg),Fe3O4纳米粒子

的比饱和磁化强度Ms下降了30%,这主要是纳米粒子的量子尺寸效应所致,在纳米尺度内,粒子的直径减小,比饱和磁化强度亦相应降低。吸附还原型和氧化型谷胱甘肽后的Ms有所下

图9　吸附前后样品的磁化曲线

Fig.9　Hysteresiscurvesofsamplesbefore

andafteradsorptionexperimental

降,一方面可能是谷胱甘肽包覆在磁性粒子的表面,抑制了其磁

[16]

运动;另一方面,由于吸附有一定量的谷胱甘肽导致了Ms下降。

3　结论

还原型和氧化型谷胱甘肽在20、40、60℃温度实验条件下能很好地吸附在磁性纳米粒子Fe3O4表面,Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附量均随温度的升高而下降。溶液中加入适量的修饰偶联剂碳化二亚胺能提高Fe3O4对还原型和氧化型谷胱甘肽的吸附量,最佳浓度为015mgΠmL。pH可影响吸附量的大小。Fe3O4对还原性和氧化型谷胱甘肽的吸附均是自发的放热吸附(ΔG<0,ΔH<0)且熵减的过程(ΔS<0)。Fe3O4与还原型和氧化型谷胱甘肽间形成了部分成分稳定的共价键,加入强电解质不能够脱附,吸附是不可逆的。Fe3O4吸附还原型和氧化型谷胱甘肽前后都为超顺磁性,但比饱和磁化强度Ms值有所下降。

参

考

文

献

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