安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２０１７ Ｎｏｖ；５２（１１） ・１５８３・ 网络出版时间：２０１７—９—８ １２：３６ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０６５．Ｒ．２０１７０９０８．１２３６．００１．ｈｔｍｌ ◇基础医学研究◇ 双光子显微镜用于在体监测小鼠 视交叉上核Ｃａ２＋动态变化的方法学研究 王聪 ，马腾飞 ，张晨 ，王元银 ，王烈成 摘要 目的通过颅底暴露手术联合双光子荧光成像技术 实现在体记录视交叉上核（ＳＣＮ）神经元钙离子活动信号并 研究其活动规律的新型方法。方法 对麻醉小鼠实行颅底 暴露手术，通过双光子荧光显微镜对已注射钙指示剂的活体 小鼠ＳＣＮ核团钙信号进行实时动态测定。结果成功建立 一套小鼠颅底暴露ＳＣＮ核团手术方法，术后应用双光子显 微镜清晰地检测到ＳＣＮ核团钙离子荧光信号，也能够实现 稳定的在体细胞钙离子成像，并发现不同自发反应细胞中钙 离子活动规律差异。结论通过颅底暴露手术，利用双光子 显微镜成功实现了实时监测ＳＣＮ区域神经元钙离子信号。 关键词双光子；荧光成像技术；在体；钙成像；视交叉上核 中图分类号Ｒ ３１９．９；Ｒ ３２２．８１１ 文献标志码Ａ文章编号１０００—１４９２（２０１７）１１—１５８３—０５ ｄｏｉ：１０．１９４０５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎｌ０００—１４９２．２０１７．１ １．００１ 双光子荧光显微镜因其可以对活体动物大面积 细胞功能活动进行三维实时监测…，且穿透性强， 信噪比小，对活体组织损伤小 而在越来越多的生 命科学研究领域扮演着重要角色，得到广泛的应用。 但由于显微镜镜头焦距短，仅能够检测活体小鼠大 脑浅层的细胞 ，因此，目前利用荧光成像技术主 要局限在在体观测实验动物的大脑颅顶皮层神经 元。视交叉上核（ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ，ＳＣＮ）是哺 乳动物最重要的昼夜节律起搏器，其调整着哺乳动 物一系列生理行为和活动，目前探索ＳＣＮ核团与周 边核团的相互作用以及在昼夜节律、睡眠的调节机 制是热点研究领域 Ｊ。但由于ＳＣＮ核团位于颅底， 对于其功能活动主要采用离体脑片神经元膜片钳和 ２０１７—０６—２７接收 基金项目：国家自然科学基金（编号：８１５７１２９３）；中国科学院脑功能 与脑疾病重点实验室开放课题（编号：２０１３－１） 作者单位： 安徽医科大学基础医学院生理学教研室，合肥２３００３２ 安徽医科大学口腔医学院，合肥２３００３２ ０北京大学生命科学学院生物膜与膜生物工程国家重点实 验室，北京１００８７１ 作者简介：王聪，女，硕士研究生； 王烈成，男，教授，博士生导师，责任作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｉｅｃ— ｈｅｎｇ＠ａｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃａ 用微电极阵列等记录技术研究神经元的功能活 动 Ｊ。除此之外，也有报道通过核磁共振成像的灰 度值来研究大脑深部的神经元能够活动 Ｊ。然而， 与双光子钙成像相比，这些研究手段有很大局限性， 不像双光子显微镜一样具有高灵敏度，并且不能采 集直接可视化的高分辨率图像和视频 。因此，该 研究通过首创的颅底暴露手术暴露小鼠颅底核团， 再联合运用双光子成像技术和荧光标记技术实现了 对活体动物ＳＣＮ神经元钙活动的实时记录。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１ 实验动物雄性健康Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，５周 龄，清洁级，购自北京维通利华公司。所有实验小鼠 手术前置于（２２±２）ｏＣ、相对湿度（５５±１０）％的有 空调装置的饲养室里，给予１２ ｈ光照／黑暗周期（光 照时间０７：Ｏ０—１９：００），小鼠养到７—８周进行试 验。将小鼠腹腔注射剂量为１０ ｍｇ／ｋｇ的麻醉药戊 巴比妥钠。麻醉深度的评估通过监测眼睑反射和呼 吸率。 １．１．２ 主要试剂 Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ＢＡＰＴＡ一１ （ＯＧＢ一１，美国Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）；人工脑脊液 成分（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１２６ ＮａＣ１，２．５ ＫＣ１，１．２ ＮａＨ２ＰＯ４，１１ Ｇｌｕｃｏｓｅ・Ｈ２Ｏ，２６ ＮａＨＣＯ３，１Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，１．２ ＭｇＣ１２・６Ｈ２Ｏ，２．５ ＣａＣ１２・２Ｈ２Ｏ，（ｐＨ＝７．４±０．５）； ＤＭＳＯ、Ａｇａｒｏｓｅ、戊巴比妥钠（美国Ｓｉｇｍａ公司）。 １．１．３仪器双光子显微镜（美国Ｔｈｏｒｌａｂｓ公司）； 双光子显微镜镜头（日本Ｎｉｋｏｎ公司）；小鼠无创血 氧仪Ｍｏｕｓｅ Ｏｘ ｐｕｌｓｅ ｏｘｉｍｅｔｅｒ（美国ＳＴＡＲＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ— ｅｎｃｅｓ公司）；ＭａｉＴａｉ飞秒激光器（美国Ｓｐｅｃｔｒａ—Ｐｈｙｓ— ｉｃｓ公司）；小鼠高速颅骨钻（深圳瑞沃德公司）；高 频手术电刀（安徽英特公司）。 １．２方法 １．２．１术前准备小鼠经戊巴比妥钠（１０ ｍｇ／ｋｇ） 腹腔麻醉后，注射丁丙诺啡（１ ｍｇ／ｋｇ）用于止痛。 通过测试小鼠反射来监测评估麻醉深度，必要情况 ・１５８４－ 安徽Ｉ￣＋Ｉ－大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｔ’ｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｐｄｉ｛’ｉｍｄｉｓ ，ｌｎｌｍｉ ２０１７ Ｎｏｖ；５２（１１） 卜ｎｆ少量补麻醉约。将小鼠氍Ｊ：加热 ＿｝二，加热垫 温度维持 ３６ ｃ【：，用小鼠尤创ｍｌ氰仪ｇ￣ｉＮｄ，鼠手术 结，容 造成ｔＪ…ｌ，因为此部位难以Ｉ卜 ，敲终会 敛小鼠ｌ人ｍ过多休克 死，但也不“过慢，， 为Ｋ时 ｎ１ＩＪ Ｉ＿ ＾，ｔｌＩｆｉ－：Ｊ，鼠，也 易造成小鼠化 ｒ术过 卜ｆ，…于很靠近颅底部位，【大ｌ此 …功率足Ｊ０ Ｗ）的持续电流进行手术 川 川 ｉ 的软腭（ ２Ｇ），再 颅中 过程巾各项生理指标，包 体温、 氧饱和度和心 半 将小鼠叭部涂ｔ二 药膏保护ＩＩ艮睛，防ＩＬ手术灯 的姒光刺激和干燥。接 给小鼠颅骨黏贴Ｉ 起【直Ｉ定 作川１的钛合金金属片．．丁＿术过程如下：前先用７５％ 乙孵溶液消毒颅顶区域皮肤，川无菌手术／Ｊ片除去 小鼠颅顶屯发；然后用镪了提起 皮用手术剪去除 Ｊ 续的 减少 除 对Ｊ川 ｎ织的 伤，需要选择一个十¨对低功 红（输 巴颅 ｒ１ 线 的 隙孵伞大小为２．５ ｎｌｉｉｌ×５．０ ｍｍ，将Ｊ州边的颅 头Ｊ叟暴露颅骨；阿用棉球沾取少： 双氧水轻轻擦拭 颅骨以 除表层筋膜，川 术 小心的剐去颅骨Ｌ 粘连的剩余肌肉黏膜 织；将定制的钛合金金属片 川５０２胶水先粘到头骨 川力按压２ ｍｉｎ左 ，待 ５０２胶水十透后，片ｊ牙科水泥将周边 隙填满。ｌ０ ｌｌｌｉｌｌ后待牙科水泥干透¨丁继续下一步试验（罔１） 嚼 图Ｉ 颅顶粘贴钛合金金属片示意图 １．２．２ 气管插管 用ｒ术 ／Ｊ 除小鼠颈前部的 己发，７５％的洒精消毒皮肤． ．－ｌＪ，，鼠颁部ＩＩ－ｉＩ｛Ｊ线 ・个１．０¨ｎ的切【＿Ｉ，川ｉｌ－ 卅钝 Ｉｌｆ：－分离肌肉组织， 醛 气管 在气管Ｉ 一个倒Ｔ Ｊ ｝７ｊ【１，将特制的 ３¨ｕ的无蔺橡胶管插入小鼠 僻（ ２Ａ） ｛ 定气 铃捅管（ ２Ｂ） ． １．２．３颅底暴露手术将＿ｒ．术ｌＵ／Ｊ的叫 性电极板 于』Ｊ【Ｊ热垫上，然后将麻 小ｌ；ｔ￣ｒｌＪ卧化同定 ｆ１性 ｝ｕ书砭饭 、用弯头止ＩｆＩＬ￣ｌｆｆ尖端紧 ｒ颌肌肉，把高 频电刀尖端垂直贴于ｍ１ ：钳尖Ｙ ｌＯ。ｊ，Ｉ札竹钳尖端沿虚 线从卜至下缓慢匀速凝烧灼 ｊ ｍ僻（ ２（ ） ．外 科ｒ术 ／Ｊ从两颗门 １Ｉ－Ｉ＇ＨＪＩｊ 小【＿Ｊ，ｉＧ－Ｊ１１岛频 Ｊ １牙（Ｊ冬｛２Ｄ）。以 过 Ｉｆ１， 选电 模式 （输¨１功率１５ ｗ），但 续实验过 『ｆｌ特遇到小鼠 ＩｎＬ僻流ｍ，则改用电凝模 （输¨ｊ功率２０ Ｗ）然 Ｊ１ｔ高频Ｆ］Ｕ刀沿图２Ｅ所，Ｊ 线ＩＵ切Ｊ｛：Ｆ领肌肉和 ｆＪｊ割 、大（Ｉ殳】２Ｆ）。在川Ｉ１ 频ＩＵ Ｉ乜切割舌头时， 意 割速度不宜过怏， 则 『１ｆ【箭尚术完全凝 骨膦薄 、 透叫状念，最后，｝ｆ＿ｊ镊子小心地从边缘掀 Ｊｆ：艘腑 ，７ｉ７１涂腔隙中碎，Ｉ日ｌｌ’，直 视｝Ｉ｝ｌ 交义及Ｊ 卜 部的小寸组织（主 足下丘脑）完全 露。、最 ・步 址极ｊ 父键的， 要细心和耐心才能降低呐组织 Ｉ札的风险， ｌＪ１０会影响成像清晰度 伞危及小鼠，卜 命（Ｉ殳】２¨） １．２．４ 注射钙指示剂Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ＢＡＰ＇Ｉ Ａ一１ 将 ，Ｊ：齐ｌＪ（）ｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ＢＡＩｑ、Ａ一１（ＯＧｔｌ—１）』｝Ｊ 玻璃微电极（３～５ Ｍｎ）缓慢注入ＳＣＮ Ｉ 域， 射深 瞍 ｌ５０～３５０ Ｉｘｍ，容秋为３ ｉｘｌ，注射川时为５～１０ Ｉｌｌｉｌｌ，然 将定删玻片（２．５ ｎｌＩｌｌ×５．０ Ｉ１１１１１） Ｉ ，ＩＩｆ川ｆ １．２％的琼脂糖压在玻片Ｉ ，以 ； 避免 ＪｌＪＬＩ￣Ｉ 撷 小鼠Ｉ呼口发抖动造成的影响（ ２１） １．２．５双光子在体成像将完成颅底 露丁．术并 射（）（Ⅲ一ｌ染料的小鼠仰卧位同定ｒ舣光ｒ 微 镜卜（ ２Ｊ） 川ｔ于拍摄的双光了． 微镜包括 捕 镜 （１６ｘ水镜，１ ２作 离：３ ｌｌｌｌｌ１）和 秒激光器 小实验ｔｆＩ舣光了激发光波长９２０ ｈｉｌｌ，¨捕频 为 ２（）．４ ｌｔｚ， 像火小为７６８ Ｘ ７６８个像索，连续¨椭 ５ ｏｏｏｇ￣，十ｎ搬深发为一１５０～一３５０ Ｉ．Ｌｌｉｉ 、 ３＾ ￣ｉ／． －Ｉ。ｉ Ｊ， 刈‘小鼠 ｛ 安乐北 、 １．３图象处理小实验中 像处 ＪｌＪ Ｍａｌｈｉｌｔ、Ｉｇ一 【ｌＩ’Ｉ｝ｒｏ６（ＷａｖｅＭｅｈ，ｉｔｓ）、ＩＩｌｌａｇｅ Ｊ，制 使川Ａｄｏｌｉｅ ｌＩ＿ ｌｕｓｔｌ’ａｌｏｉ ＣＳ３、Ａ｛ｈ｝１）ｔ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３等软什 ２ 结果 ２．１ 双光子荧光显微镜在体钙成像检测 将术Ｊ 荧光标 的小鼠通过舣光子荧光显微镜进 成 像愉测，成像深度为】５０～４００ ｍ，镜 能够消晰观 察刨帧 浅 ｍ管、胶质细胞和 Ｎ 域ｆｌ１Ｉ绛 （ ３） １ｔ Ｊ ＩＪｆ见，｝『Ｉ１经细胞聚集 一起Ｊｉ０ｊ 竹 肜成・个惭 的 络结构 ． ２．２ ＳＣＮ区域神经元的自发钙信号 川舣光ｒ ｌｌｊ’ 做镜ｘ，Ｊ‘Ｓ（２Ｎ Ｊ 域｝Ｉ１Ｊ经冗进＂荧光 １拊和｝ 求将 ｝ 的｛－ｔ捕 片利川ｍａｔｌａｂ软件随机选取¨｛脱Ｉ 发』乏Ｊ ，Ｊ｝】Ｉ１ ，ＩＩ｜通过ｈｎａｇｅ Ｊ软什和Ｉ１ｇⅢ’１）ｒ｛ ６ ・１５８６・ 安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２０１７ Ｎｏｖ；５２（１１） 次运用于生物科学研究以来 ，因其可以对大面积 活细胞进行三维实时监测，具有穿透性强，信噪比小 能与其调控生物节律和内环境稳态功能活动相一 致，而大脑皮层神经元主要调控躯体运动和感觉的 反射性活动。 和光对活体组织损伤小等技术优势而迅速发展，已 从离体研究拓展到在体研究，从通过磨薄的颅窗来 观察皮质神经元的功能活动 到开颅观察皮质神 经元的功能活动¨ ，从而推进了神经科学的研究。 但目前人们对双光子显微镜在体中枢神经系统检测 中的应用尚停留在颅顶皮质神经元，主要原因是颅 顶皮质神经元暴露的手术比较简单，易于操作，实验 动物存活率高且实验观察时间长。而颅底虽然有很 多重要的核团，比如ＳＣＮ，有着“昼夜节律生物钟” 参考文献 ［１］Ｌｉ Ｊ，Ｄｏｎｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｑｕａｎｔｕｍ—ｄｏｔ－ｂａｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｇｌａｓｓ：ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｍｅｃｈａ— ｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１６，８（３６）：１６４４０—８． ［２］Ｌｉ Ｃ Ｙ，Ｃａｏ Ｄ，Ｑｉ Ｃ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｗｈａｌｅ ｓｅｒｎｍ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ— ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２０１７，９０：１４６—５２． 之称，在昼夜节律的产生中起到极其重要的作用。 ［３］Ｃｈｅｎ ｘ，Ｌｅｉｓｃｈｎｅｒ Ｕ，Ｖａｒｇａ Ｚ，ｅｔ ａ１．ＬＯＴＯＳ－ｂａｓｅｄ ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１２， ７（１０）：１８１８—２９． ＳＣＮ内有多种功能的神经元，因在神经元化学表型、 输入和输出方面存在着差异从而在昼夜节律功能中 起到不同作用，而昼夜节律紊乱与机体疾病的发生、 发展和预后密切相关。如果能应用双光子显微镜对 ＳＣＮ神经元进行三维实时监测，再结合电生理检测 和药理学分析，对实时观测不同类型的ＳＣＮ神经元 ［４］Ｅｄｗａｒｄｓ Ｍ Ｄ，Ｂｒａｎｃａｃｃｉｏ Ｍ，Ｃｈｅｓｈａｍ Ｊ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｒｈ￣ｈｍｉｃ ｅｘ． ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ ｏｆ ａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１６，１１３（１０）：２７３２—７． ［５］Ｈａｎｎａ Ｌ，Ｗａｌｍｓｌｅｙ Ｌ，Ｐｉｅｎａａｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｉｃｕｌｏｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ ｇａｔｅ ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ 功能规律及神经网络通讯机制都具有极高的应用价 ｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｐｕｔ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１７，５９５（１１）：３６２１—４９． ［６］ＨａｎｋｉｒＭＫ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ＪＲ，Ｂｌｏｏｍ Ｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｇｌｕ． ｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｎ ｍｏｕｓｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ａｎｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｅｎ－ 值。对进一步揭示ＳＣＮ不同类型的核团在昼夜节 律调控中的功能发生机制提供有利的帮助。 不过颅底暴露手术相较于颅顶暴露手术要复杂 得多，难度也较大。比如手术过程易出血的地方比 较多，手术中必须采用电刀电凝止血；开颅的难度也 ｈａｎｃｅｄ ＭＲＩ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ，２０１２，５９（２）：９６８—７８． ［７］ Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｋ，Ｘｕａｎ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｗｏ－ｐｈｏ－ ｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ 比较大，需将颅骨磨薄后再小心揭开颅骨等等。正 因为有如此大的难度，故之前未见这方面的报道。 本实验开创性地探索出通过颅底暴露手术，运 用双光子荧光成像技术，首次实现对活体小鼠ＳＣＮ 核团内钙信号的探测，实现了对颅底大面积活细胞 ｄａｍａｇｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１６，５２（３７）：６３０８— １１． ［８］ＧｉｂｂｓＫ Ｌ，Ｋａｌｍａｒ Ｂ，Ｓｌｅｉｇｈ Ｊ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｉｎ ｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ａｘｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏ￣ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１６，２５７：２６—３３． ［９］Ｓｉｌａｓｉ Ｇ，Ｂｏｙｄ Ｊ Ｄ，Ｌｅｄｕｅ Ｊ，ｅｔ １．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔａｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｇｈｔ—ｂａｓｅｄ ｍｏｔｏｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ：ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｃｃｅｌｅｒｏｍｅｔｅｒｓ，ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ＥＥＧ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｉｎ ａ ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｔｈｉｎ． 进行三维实时监测。神经元网络自发钙活动携带着 丰富信息，本研究显示ＳＣＮ区域神经细胞的自发钙 活动并不一致，且相较于视皮层神经元自发钙活动 的频率，颅底神经元自发钙活动发生频率远低于视 皮层神经元，即使是爆发期也不及皮质神经元，不过 一ｓｋｕｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ，２０１３，７：１２３． ［１０］Ｉｓｓｈｉｋｉ Ｍ，Ｏｋａｂｅ Ｓ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒａｎｉｌａ ｗｉｎｄｏｗ ｔｙｐｅｓ ｏｒ ｆｉｎ ｖｉｖｏ ｔｗｏ—ｐｈｏｔｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｃｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （Ｏｘｆ），２０１４，６３（１）：５３—６３． 次钙活动的持续时间远高于视皮层神经元，这可 Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｗａｎｇ Ｃｏｎｇ ，Ｍａ Ｔｅｎｇｆｅｉ ，Ｚｈａｎｇ Ｃｈｅｎ ，ｅｔ ａｌ （ Ｄｅｐｔ ｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＢａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３２： Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３２； Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ ６０ｒａｔｏｒｙ ｆ ｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７ １） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｋｕｌｌ ｂａｓｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｎｄ ｒｅｃ０ｒｄ ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｖ ｏｆ 安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｔｄ ２０１７ Ｎｏｖ；５２（１１） ・１５８７・ 网络出版时间：２０１７—９—８ １２：３６ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０６５．Ｒ．２０１７０９０８．１２３６．００２．ｈｔｍｌ 肝细胞损伤模型中银杏内酯Ａ保护机制 及对Ｎｒｆ２一抗氧化酶的影响 姜摘要璐 ，向楠 ，姜侠。，王伟芹 目的 探讨银杏内酯Ａ对四氯化碳（ＣＣ１ ）诱发的 采用 过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ｐ３８通路上调Ｎｒｉ２、ＨＯ一１、ＧＳＨ表达、抑制氧化 应激反应有关。 关键词 银杏内酯Ａ；ＨｅｐＧ２细胞；四氯化碳；氧化应激； Ｎｒｔ２；ＨＯ一１；ＧＳＨ ＨｅｐＧ２细胞损伤是否具有保护作用，并观察其对核因子Ｅ２ 相关因子２（Ｎｒｔ２）调控的抗氧化酶的作用。方法ＣＣ１ 诱发ＨｅｐＧ２细胞损伤，并予以不同剂量的银杏内酯Ａ 对其进行干预治疗，ＭＴＹ法检测细胞活性，ＥＬＩＳＡ法检测细 中图分类号Ｒ ９６２ 胞培养液中谷草转氨酶（ＡＳＴ）、谷丙转氨酶（ＡＬＴ）浓度，并 观察细胞８－羟基脱氧鸟苷（８－ＯＨｄＧ）、丙二醛（ＭＤＡ）、Ｎｒｆ２、 血红素氧合酶１（ＨＯ－１）、谷胱甘肽（ＧＳＨ）水平。进而采用 文献标志码Ａ文章编号１０００—１４９２（２０１７）１１—１５８７—０５ ｄｏｉ：１０．１９４０５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎｌ０００—１４９２．２０１７．１ １．００２ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＭＡＰＫ通路拮抗剂干预，探索介导银杏内酯Ａ发 挥作用的上游通路。结果 与对照组比较，ＣＣ１ 组ＨｅｐＧ２ 细胞活性降低，细胞培养液ＡＳＴ、ＡＬＴ浓度增加，细胞８－ ＯＨｄＧ、ＭＤＡ水平升高（Ｐ＜０．０５）。而与ＣＣ１ 组比较，银杏 肝脏在物质代谢、维持机体平衡方面具有重要 作用。许多化学、生物等因素可导致肝脏损伤，进而 引起肝硬化等，影响机体健康。过强的氧化应激反 应是多种致病因素引发肝脏损伤的共同机制之一， 抑制过强的氧化应激反应被认为是治疗肝损伤的一 项重要策略 。多种中药及其提取物被证实具有 抗氧化作用并被用于治疗肝脏疾病ｌ２］。银杏内酯Ａ 是中药银杏干燥叶的提取物之一，研究 显示银杏 内酯Ａ具有抗氧化活性，并被用于多种疾病的治 内酯Ａ可剂量依赖性的升高ＨｅｐＧ２细胞活性，降低ＡＳＴ、 ＡＬＴ浓度，降低８－ＯＨｄＧ、ＭＤＡ水平，同时显著升高Ｎｒｔ２、ＨＯ． １、ＧＳＨ水平（Ｐ＜０．０５）。此外，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ拮抗剂ＬＹ２９４００２ 与ｐ３８拮抗剂ＳＢ２０３５８０显著减弱了银杏内酯Ａ对ＨｅｐＧ２ 细胞的保护作用，并抑制了银杏内酯Ａ对Ｎｒｆ２、ＨＯ一１、ＧＳＨ 表达的上调作用（Ｐ＜０．０５）。结论银杏内酯Ａ对ＣＣ１ 诱 发的ＨｅｐＧ２细胞损伤具有保护作用，其机制之一可能与通 ２０１７—０５—３１接收 疗。但银杏内酯Ａ是否对肝脏损伤具有保护作用 未见报道，该研究拟观察银杏内酯Ａ对ＣＣ１ 诱发的 基金项目：山东中医药管理基金（编号：２００９．３３） 作者单位： 山东中医药大学附属医院消化内镜诊疗科，济南 ２５ｏｏ１４ ＨｅｐＧ２细胞损伤的保护作用，并探讨其可能机制。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１细胞株ＨｅｐＧ２细胞购自中国科学院上海 山东中医药大学，济南２５０３５５ 山东中医药高等专科学校中医经典教研室，烟台 ２６４１９９ 山东中医药大学附属医院，济南２５００１４ 细胞库。 １…１ ２药品、试剂与仪器ＭＴＹ、ＣＣ１ 、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ拮 作者简介：姜 璐，女，硕士，主治医师，责任作者，Ｅ—ｍａｉｌ 】８６】５２】８０９９＠１６３．ｃｏｎ 抗剂ＬＹ２９４００２、ＪＮＫ抑制剂ＳＰ６００１２５、ｐ３８抑制剂 ＳＣＮ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｓｋｕｌｌ ｂａｓｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｗａｓ ｐｅｒ－ ｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ＳＣＮ ｗｅｒｅ ｒｅａｌ－－ｔｉｍｅ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｂｙ ｔｗｏ・－ｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓ－－ ｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｆｔｅｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎｊｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｅｘｐｏｓｅ ｔｈｅ ＳＣＮ ａｔ ｓｋｕｌｌ ｂａｓｅ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ＳＣＮ ｗｅｒｅ ｃｌｅａｒｌｙ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｄｉｄ ｎｏｔ ｑｕｅｎｃｈ ｆｏｒ ａ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｌａｓｅｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｍａｇｉｎｇｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｅｒｅ ｓｔａｂｌｙ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｏｕｔｉｎｅ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｅｘｐｏｓｉｎｇ ｓｋｕｌｌ ｂａｓｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ，ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ＳＣＮ ａｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｒｅａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ；ｉｎ ｖｉｖｏ；ｃａｌｃｉｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ；ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ