CHIP实验流程图(CST9002)

第一天

A体内交联，细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质

预热的试剂：200X蛋白酶混合抑制剂 1 M的二硫苏糖醇 0.1 M PMSF

10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：50ml离心管 4个

1.5ml EP 7个

水浴锅 37°C

15ml离心管 4个

台式冷冻离心机 4°C 配液并预冷：10X 甘氨酸溶液 10 ml 1X PBS 200 ml 1mMPMSF：1X PBS 30 ml PMSF 300 μl 1X缓冲液 A（10ml）：

4X缓冲液A 2.5 ml

水 7.5 ml

1 M DTT 5 µl

200X PIC 50µl

0.1MPMSF 100 µl 1X 缓冲液 B（11ml）： 4X 缓冲液B 2.75 ml 水 8.25 ml 1 M DTT 5.5 µl

1X ChIP缓冲液（1.25ml）：

10X ChIP缓冲液 125 µl

水 1125 µl

200X PIC 6.25µl PMSF 12.5 μl

2个10cm培养皿（90%）+10ml培养基 额外一盘细胞用于测定细胞数 270 µl 37%的甲醛/10ml培养基、转动混匀，室温放置10min 甲醛的终浓度为 1% 培养基会变色 1 ml 10X 甘氨酸、转动使之混匀，室温孵育5min 培养基会变色 弃培养基、冷PBS漂洗两次（10 ml /次） 彻底弃净PBS 2 ml冷1X PBS + PMSF、刮下细胞并合并收集 2ml、1 ml冷1X PBS + PMSF依次冲洗合并收集 4°C 1500rpm离心5分钟，弃上清 加入3.385 ml冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF重悬细胞。冰上孵育10min 3min颠倒混匀1次 4°C 3000rpm离心5分钟，弃上清 加入3 ml冷缓冲液 B + DTT重悬细胞核 4°C 3000rpm离心5分钟，弃上清 加入400µl冷缓冲液 B + DTT重悬细胞核，将样品转移到1.5 ml离心管 加入2 µl微球菌核酸酶，颠倒混匀数次，37°C孵育20 min 5min颠倒混匀1次，150-900 bp 加40 µl 0.5 M EDTA终止消化,置冰上;4°C 13000rpm离心1min，弃上清 加入400µ1X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF重悬细胞核，冰上孵育10min 超声20s，冰上孵育30s破碎核膜，共3次；4°C 10000rpm离心10min 上清（交联的染色质）移到新管子中， -80°C保存，取50 µl分析DNA的酶切情况及其浓度 B. 分析染色质的浓度和酶切情况（推荐步骤）

准备：在DNA漂洗液中加入24 ml无水乙醇

1.5ml EP 3个

水浴锅 65°C

DNA离心柱： 3个 DNA收集管： 3个

50 µl的染色质样品 来源于A中最后一步 加100 μl无核酸酶的水，6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A 涡旋震荡，37℃30min 加入2 μl 蛋白酶K 涡旋震荡，65℃2h 加入750 µl DNA结合缓冲液 涡旋混匀器稍加震荡 DNA离心柱插入到收集管中并做标记 吸取450 µl样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30sec 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 吸取450 µl样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30sec 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 在离心柱中加入750 µl的DNA漂洗缓冲液 14000rpm离心30sec 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 14000rpm离心30sec 取出离心柱，插入到干净的1.5 ml离心管中，将收集管和废液一起丢弃 在离心柱中加入50 µl DNA 洗脱缓冲液 14000rpm离心30sec 丢弃DNA离心柱 DNA测含量、-20°C保存、取10 µl经1%琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段大小为150-900 bp C. 染色质免疫沉淀 预热的试剂：200X蛋白酶混合抑制剂 交联的染色质样品（来自A部分最后一步） 10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：1.5ml EP 11个 15ml离心管 5个 台式冷冻离心机 4°C 预冷：ChIP级的G蛋白琼脂糖微球 #9007 免疫沉淀所用的抗体：USP22 ubH2B H2B 组蛋白H3 正常兔IgG 注意：交联的染色质样品也可以进行稀释，将抗体直接添加到未稀释的染色质样品中沉淀染色质复合物

第二天

10 X ChIP 缓冲液： 420 µl 配制1 X ChIP缓冲液（4.2ml） 水： 3.78 ml 蛋白酶混合抑制剂： 21 μl 分装到4个15ml管 1.2ml、1.2ml、1.2ml和0.6ml 分别加入0.3ml、0.3ml、0.3ml、0.15ml+0.05ml消化后的染色质样品 10-20µg染色质DNA 取10 µl转移到微量离心管中（3个）即2%样品输入对照，-20°C保存 500 µl稀释的染色体样品到各个离心管 USP22 2.2µl 3管 ubH2B 2µl 3管 加入对应的抗体 H2B 2µl 3管 组蛋白H3 10µl 1管 4°C的转子上孵育过夜 正常兔IgG 5µl 1管 加入30 μl的ChIP级的蛋白G 4°C的转子上孵育2h 开始D部分操作 D. 漂洗免疫沉淀的染色质： 预热的试剂：10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：50ml离心管 1个 15ml离心管 1个

台式冷冻离心机 4°C

配液并预冷：

低盐漂洗液: 10 X ChIP缓冲液 3.3ml

水 29.7 ml

高盐漂洗液: 10 X ChIP 缓冲液 1.1ml

水 9.9ml

5M NaCl 770 µl

E. 将染色质从抗体/蛋白G微球上洗脱并解交联 预热的试剂：2X ChIP洗脱缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：15ml离心管 1个 1.5EP管 11个 台式冷冻离心机 4°C

水浴锅 65°C

配液：1 X ChIP洗脱缓冲液:

2 X ChIP洗脱缓冲液 1.125ml 水 1.125ml

将样品4°C 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 加入1 ml低盐漂洗液重悬微球 4°C转子上孵育5min 将样品4°C 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 加入1 ml低盐漂洗液重悬微球 4°C转子上孵育5min 将样品4°C 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 加入1 ml高盐漂洗液重悬微球 4°C转子上孵育5min 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 2%样品输入对照 加入150 µl 1 X ChIP洗脱缓冲液 加入150 µl 1 X ChIP洗脱缓冲液 1200 rpm涡旋震荡65°C孵育30min，室温也可 室温放置 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球 将上清移至新管 加入6 µl 5 M NaCl和2 µl 蛋白酶K，65°C孵育2h 用离心柱纯化DNA。

准备：1.5ml EP 14个 水浴锅 65°C DNA离心柱： 14个 DNA收集管： 14个

150 µl的染色质样品 来源于E中最后一步 加入750 µl DNA结合缓冲液 涡旋混匀器稍加震荡 DNA离心柱插入到收集管中并做标记 吸取450 µl样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30s 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 吸取450 µl样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30s 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 在离心柱中加入750 µl的DNA漂洗缓冲液 14000rpm离心30s 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 14000rpm离心30s 取出离心柱，插入到干净的1.5 ml离心管中，将收集管和废液一起丢弃 在离心柱中加入50 µl DNA 洗脱缓冲液 14000rpm离心30s 丢弃DNA离心柱 DNA测含量、-20°C保存，用于PCR或定量PCR定量DNA含量 F.G. 实时定量PCR方法： 建议：

• 实验中使用带滤芯的头以尽可能减少污染的可能性。

• 试剂盒中所包含的对照引物特异性识别人或小鼠的RPL30基因，既可以用于常规PCR也可以用于实时定量PCR。如果用户做的ChIP样品来源于其它他物种，

建议客户设计合适的特异对照引物并优化PCR反应条件。

• 建议使用热启动Taq聚合酶以减少产生非特异PCR产物的风险。 • PCR引物的选择很关键。引物应尽可能按照下列标准来设计：

引物长度: 最佳Tm值： 最佳GC含量: 扩增片段长度：

实时定量PCR方法：

1. 选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板，做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及监控DNA污染的不加DNA模板

的空白组对照。另外在加入反应体系前，将2%样品输入对照做一系列稀释（不稀释，1：5，1：25，1：125），据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。 2. 在每个反应管或孔（板上）中加入2 μl相应DNA模板。

3. 按下面配比配置PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。

试剂 无核酸酶的水 5 μM RPL30 引物 SYBR-Green反应体系 4. 按下面程序执行PCR：

a. b. c. d.

预变性 变性 退火及延伸：

重复第2及第3步，共40个循环

95°C 3 分钟 95°C 10 秒 60°C 30 秒

每个PCR反应（20 μl）所需体积 6 μl 2 μl 10 μl 24个核苷酸 60°C 50%

150-200 bp（用于常规PCR） 80-160 bp （用于实时定量PCR）

5. 用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。