细胞冻存

实验课程：细胞工程 实验内容：细胞冻存

一 实验目的

掌握低温液氮冻存的原理，学习细胞缓慢冻存实验方法 二 实验器具

（冻存罐）

（冻存管）

（冻存管托）

三 实验原理

低温液氮冻存贮存细胞是细胞培养室常规通用技术。这不仅避免了在培养器具、培养液及各种准备工作方面人力物力时间的大量耗费，也避免增加污染的机会；并防止了在多次传代和体外环境变化时细胞发生遗传性状的不稳定。液氮中温度可达-196℃，细胞贮存的时间理论上是无限的，解冻后细胞仍能生长繁殖。为培养工作提供了极大的方便。

在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水分会很快结成冰晶，能导致细胞发生一系列不良反应如脱水、电解质浓度增高、渗透压改变pH改变、蛋白质变性、机械损伤等，最终导致细胞死亡。

如向细胞培养液中加入一些保护剂，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，避免上述现象的发生甘油和二甲亚砜是目前最常使用的保护剂，它们对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，提高细胞膜对水的通透性，而对细胞内酶和蛋白质等则具有一定的保护作用。保护剂的使用浓度一般在5%～15%。

降温方法：使用降温仪：以-1～-2℃/min的降温速率→ -25 ℃以下→以-5～-10℃/min的降温速率→-100 ℃ →迅速浸入液氮中。

分步降温：4 ℃放置30～60 min →-70～-80 ℃放置1～2天→迅速浸入液氮中。 四 实验步骤 （一）细胞悬液准备

 75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。  取对数生长期的细胞，将培养液倒入废液缸中。向培养瓶内加入3ml PE液，平放轻摇。

 向培养瓶内加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶消化液，轻摇。拍打悬浮后，制备成单细胞悬液（内含活细胞和死细胞）。 （二）冻存

 取对数生长期细胞，在冻存前24小时换培养液一次。  按上步骤制成细胞悬液。

在细胞悬液中加入2ml冻存液，吹吸数次使细胞均匀悬浮，→ 取0.5～0.8 ml分装入细胞冻存管内，密封，在管上做好标记，放于小试管架上，→ 放入4～5℃冷藏箱中30～45分钟，使冷冻保护剂充分渗入细胞内，与细胞达到平衡，→放入-75℃，1天，→快速放入液氮罐的试管托内，沉入液氮中。 五 注意事项

 为保持细胞最大存活率，复苏细胞与冻存细胞要求相反，应采用快速融化的手段，这样可以保证细胞外的结晶在很短的时间内即融化，使细胞迅速通过最易受损的-5～0℃温度段，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

 实验操作人员在冻存复苏细胞过程中，要有自我保护意识，避免被液氮冻伤。操作时应带好眼镜和手套。

 冻存时，应仔细检查细胞冻存管是否密封，以免复苏时因受热发生爆炸伤人。

 液氮罐应存放于通风良好处，以便氮气逸出后散开，液氮量应定期检查，挥发至一半时要及时补充。

 细胞冻存悬液一旦融解后，应尽快弃除冷冻保护液，因二甲亚砜在常温下对细胞会产生毒性。

六 实验结果

（对数生长期细胞）

（加入胰酶后）

七 思考题

查阅有关资料，简述5项近年来细胞冻存的研究成果和应用。 1. 2006年 小鼠卵母细胞的OPS 法玻璃化冷冻保存技术

以小鼠卵母细胞为模型, 利用开放式拉长细管( open pulled straw, OPS) 法研究在不同条件下冷冻、解冻对其发育能力的影响, 为家畜、濒危动物乃至人类探索一种简易、高效的卵母细胞冷冻保存提供理论与技术参考。

2. 2010年 女性肿瘤患者卵母细胞冻存的研究

随着医学发展，女性肿瘤患者生存期限延长，这部分人的生育问题成为医务人员关注的热点。对于肿瘤的治疗如放疗、化疗会显著影响卵巢功能甚至导致卵巢功能衰竭。卵母细胞冻存因其所用时间短、花费低，不受月经周期限制，对患者身体各方面影响小及相对安全等优势，受到临床工作者的关注。

3．2010年 高压冷冻技术在拟南芥细胞微结构研究中的应用 结果显示，在拟南芥根及叶片中，高压冷冻技术可以有效地避免常规制备样品中的细胞壁收缩，细胞质不均匀分布，高尔基体及质体收缩，细胞膜及液泡膜皱缩甚至断裂等现象，使细胞结构更接近其生活时的状态。