各种酶活性测定方法

小组第一次讨论结果：

一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

1.原理

APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法

（1）采用碘液滴定法:

称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。

（2）紫外吸收法：

称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。 APX总活性(uM·g-1·min-1) = △OD×Vr/ (A×d×Vt×W×△t)

△OD：反应时间内吸光度的变化； △t：反应时间，min；

Vr：提取液体积，mL； A：消光系数，2.8mM-1﹒cm-1； d：比色杯厚度，1cm； Vt：测定液体积，mL； W：样品鲜重，g。

二、 过氧化氢酶（CAT）活性测定

1.原理

过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白，含有铁，能够催化过氧化氢分解为水和氧分子，此过程中起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂，因此可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。 2.CAT活性测定方法 碘化钾滴定法：

本方法利用H2O2能将KI中的I-氧化，生成I2，以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成I2的量，再换算所消耗H2O2的量。取100ml三角瓶6个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml立即向4、5、6号瓶中各加入3.6ml/L硫酸5ml以终止反应。作为空白测定然后将各瓶放在20错误！未找到引用源。水浴中保温，待瓶内温度达到20错误！未找到引用源。时，并向各瓶准确加入5ml0.1mol/LH2O2摇匀，记录时间。5min后再依次向1、2、3号瓶中各加入3.6mol/L硫酸5ml终止酶促反应，然后向每瓶各加20%碘化钾1ml，3滴钼酸铵及5滴淀粉指示剂。用0.02mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失

过氧化氢酶活性=错误！未找到引用源。

A：空白值滴定值（ml） B：样品滴定值（ml） C：Na2S2O2浓度（mmol/L） a：测定时酶液用量（ml） V：酶液总体积 W：样品重（g）

t：反应时间（min） 17:1/2H2O2的摩尔质量（mg） 2.紫外吸收法：

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。测量吸光率的变化即可测出过氧化氢酶的活性。 试管号 提取液（ml） 缓冲液（ml） 蒸馏水（ml） S1 0.4 3.0 2.0 S2 0.4 3.0 2.0 S3 0.4失活酶液 3.0 2.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，计算。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶活性[u/(g×min)]= A240×VT/(0.1V1×t×W)。其中A240 = AS3- (AS1-AS2)/2； AS1、AS2样品管吸光值； AS3加入失活酶液的对照管吸光值； VT粗酶提取液总体积(ml)； V1测定用粗酶液体积(ml)； W样品鲜重(g)； 0.1是A240每下降0.1为1个酶活单位(u)； t加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

三、过氧化物酶（POD）测定方法

1.原理

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量． 2.POD活性测定方法 比色法：

称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。 2 、取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

3、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 过氧化物酶活性 [u/ （ g · min ）

ΔA470为反应时间内吸光值的变化； W为所称样品重，g；

t为反应时间，min； VT为提取酶液总体积，ml； VS为测定时取用酶液体积，ml。

四、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）

定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000r / min 离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定

（1）反应混合液配制：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；

（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中

（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光

度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。