mirna簇基因在山羊组织和不同时期的c2c12细胞的表达分析

在不同组织山羊表达特征和成肌细胞中表达水平。【方法】本研究采用qRT-PCR方法检测miRNA簇基因在山羊组织以及C2C12

细胞不同生肌时间点的动态表达模式。【结果】miRNA簇基因(miR-665, miR-127-5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR432-5p, miR- 432-3p和miR433)在不同波尔山羊组织中均广泛表达。miR-127-5p,miR-136-3p, miR432-5p,miR432-3p和miR433在山羊肌肉

中高表达,miR-136-5p和miR«65在肌肉表达量低。miR-136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐浙升高；miR-127-5p,miR432-3p,

miR432-5p,miR433和miR-136-5p表达量呈现先升高后降低的趋势;miR-665在随C2C12细胞增殖和分化表达逐浙降低。【结

论】本研究结果为进一步阐明miRNA簇基因调控骨骼肌的生长发育的调控功能奠定了理论基础。关键词:miRNA簇；体组织；C2C12细胞;表达分析；中图分类号:S827

文献标识码:AExpression Analysis of miRNA Cluster Genes in Goats Tissues and Different Periods of C2C12 CellsLI Jie, REN Hang-xing, WANG Gao-fu, JIANG Jing, SUN Xiao-yan, ZHOU Peng*(Herbivorous Livestock Institute, Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing Rongchang 402460, China)Abstract: [ Objective ] The present paper aimed to clarify miRNA cluster genes ( miR-665, miR-127-5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR-432- 5p,miR-432-3p and miR-433) in expression characteristics of goats tissues and dynamical expression of proliferating and differentiating C2C12 Cells. [ Method] qRT-PCR was used to detect the expression patterns of miRNA cluster genes in different tissues of Boer goats and different growth time points at myoblast proliferating and differentiating. [ Result] miRNA cluster genes ( miR-665 , miR-127-5p, miR-136- 3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p and miR-433) were widely expressed in different tissues of Boer goats, miR-127-5p,miR-136- 3p,miR-432-5p,miR-432-3p and miR-433 were highly expressed in muscle of Boer goats, miR-432-5p and miR-665 were lowly expressed in

muscle. Besides, miR-136-3p were expressed increasingly during proliferation and differentiation of C2C12 cells, the expression level of miR-127-5p, miR-432-3p, miR-432-5p, miR-433 and miR-136-5p increased first and then decreased, miR-665 was expressed decreasingly

in C2C12 Cells. [ Conclusion] The results of this study provide a theoretical basis for further clarifying miRNA cluster genes in regulation of

skeletal muscle growth and development.Key words:miRNA cluster； Tissues； C2C12 cell； Expression analysis【研究意义】骨骼肌的形成是一个高度复杂且 这些复杂过程的顺利进行不仅受许多编码蛋白的因

有序的生物学过程，主要包括成肌决定,成肌细胞增 殖,细胞周期的退出，肌肉特异性基因的表达，肌细

子调节，如成肌调节因子家族(MRFs),肌细胞增强

子因子2家族(MEF2)和对框基因(Pax)家族，而且 还受到非编码RNAs的调控，如microRNAs ( miR- NAs)。【前人研究进展］miRNAs是一类新发现的

胞融合形成多核肌管,多核肌管再经过一系列发育 变化，最后分化成为具有功能的成熟肌纤维3］。收稿日期：2019 - 02-15基金项目:重庆市农发资金项目(15404)作者简介:李 杰(1989 -),男，助理研究员，主要从事山羊遗 传育种研究,E-mail：cqhyljie@ 163. com, *为通讯作者:周 鹏， 男,研究员，研究方向为动物遗传育种，E-mail ：zp2006@ 163.como

非编码小分子RNA,长约22nt(核昔酸)，通过与靶

mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降

解、稳定性下降或者抑制其翻译，从而调控基因的转

录后表达水平⑶。研究表明,miRNAs参与了增殖、

分化、凋亡、发育从细胞到个体的整个生命过程及肿

176蜀鬲农北爭叔.33卷瘤发生过程⑷。miR-665 , miR-127-3p/5p, miR-136-

3p/5p, miR432-3p/5p 和 miR433 同位于山羊 21

号染色体，形成一个特殊的miRNA簇。笔者前期用

高通量测序（RNA-Seq）法对Texel羊（MSTN突变

型）与乌珠穆沁羊（MSTN野生型）胎儿骨骼肌miR-

NA进行转录组测序，发现miR-127-3p与miR-1/ 206/133在两品种羊骨骼肌中在骨骼肌高表达miR- NAs,且miR-127-3p在2个品种羊骨骼肌中差异表

达⑸。Li等的研究发现miR-127-3p在波尔山羊肌 肉组织表达量高于巫山黑山羊，同时miR-127-3p在

增殖的C2C12细胞的表达量高于分化时期的细

胞国。【本研究切入点】而位于同一个miRNA簇的

miR-665, miR-127 -5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR- 432-5p,miR^32-3p和miR433在山羊组织和细胞

的表达模式目前尚未见相关的文献报道。本研究首 先以波尔山羊体组织为试验材料，检测在不同组织

中 miRNA 簇基因（miR-665 , miR-127-5p, miR-136- 3p, miR-136-5p, miR432-5p, miR432-3p 和 miR-

433）的表达情况，接着分别检测C2C12细胞增殖与 分化不同生肌时间点第0、2、4、6、8天中miRNA簇

基因动态表达模式。【拟解决的关键问题】为阐明

miRNA簇基因在骨骼肌的生长发育的调控作用提

供一定的理论依据O1材料与方法1.1试验材料在巫山县振兴农牧科技开发有限公司随机选取 3只成年的波尔山羊，屠宰后立即采集样品，DEPC

水清洗后装管置于液氮中，用于肌肉组织RNA提 取。C2C12细胞为本实验室保存。TRIzol Reagent

购自 invitrogen 公司（美国）；miScript II RT Kit 与

miScript SYBR Green PCR Kit 均购自 QIAGEN 公司 （德国）；DMEM培养基购自gibco公司（北京）；胎牛

血清（FBS）、马血清（HS）和青链霉素购自HyClone

公司（新西兰）；其他化学试剂均为国产分析纯。12细胞培养C2C12细胞生长培养基（GM）为含10 %胎牛

血清的DMEM培养基。当细胞融合度达到85 %左

右时更换为分化培养基（DM）为含2 %马血清的 DMEM培养基,GE和DM中均需均加入1 %的双

抗，隔天更换一次培养基。分别在增殖和分化阶段

的0、2、4、6、8 d收集细胞，用于提取细胞的miRNA。 13 miRNA的提取与反转录组织提前用液氮充分研磨,细胞吸弃培养基后,

用PBS清洗2 ~ 3次，加入TRIzol提取RNA。组织 和细胞的总 RNA 按照 TRIzol Reagent （Invitrogen,美表1 miRNA簇基因引物序列信息Table 1 Primer information of miRNA cluster genes基因引物序列（5—3，）GenePrimers sequences （5，・3 '）miR-665ACCAGTAGGCCGAGGCCmiR-127-5pAAGCTCAGAGGGCTCTGATTmiR-136-3pAGCATCATCGTCTCAAATGAGTCTmiR-136-5pACGACTCCATITGTnTGATGATGGmiR-432-5pTCTTGGAGTAGGTCATTGGGTGmiR/32-3pACTGGATGGCTCCTCCATmiR433ATCATGATGGGCTCCTCGU6AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG国）提取试剂盒的操作步骤提取。RNA完整性用1

%琼脂糖凝胶电泳检测，浓度和纯度采用NanoDrop

2000超微量分光光度计（Thermo,美国）检测。经

检测完整性良好的RNA用miScript II RT Kit（QIA-

GEN,德国）反转录合成cDNA。其中反应体系为20

山,包含3（±1（400 ng/|jLl） ,5 xmiScript HiSpec Buffer

4 |il, 10 x miScript Nucleics Mix 2 |jl1, miScript Re­

verse Transcriptase Mix 2 |±1, RNase ddH2O 9 心。合

成产物-20咒保存备用（表1）。1.4 RT-qPCR按照 miScript SYBR Green PCR Kit （QIAGEN,

德国）试剂盒说明书，对组织与细胞进行荧光定量

检测分析,U6作为内参基因。反应体系（20讪）：模 板 cDNA 1 |jl1,2 x QuantiTect SYBR Green PCR Mas­ter Mix 10 pul, 10 X miScript Universal Primer 和引物 各1心,RNase ddH2O 7 jxlo反应程序：95 °C预变

性15 min,94咒 变性15 s,55 °C退火30 s,70咒延 伸30 s,共40个循环。每个样品重复3次,所有反 应在 7900HT Fast Real-Time PCR System （ Applied

Biosystems，美国）中进行。15数据分析RT-qPCR中miRNA相对表达量用2 \"人仔法计

算，结果以平均值土标准误（mean 土 SE）表示。2结果与分析2.1 miRNA簇基因在山羊染色体的位置分布由图1可知,miRNA簇基因分布于山羊21号染色体,miR-665位置较前,而其他miRNA在染色联

|

| |nlH-lM-JpiTpChromosome 21-NC_030828.1图1 miRNA簇基因在山羊染色体的位置Fig. 1 miRNA cluster genes in the position of goat chromosome1期李 杰等:miRNA簇基因在山羊组织和不同时期的C2C12细胞的表达分析177a.4■S .3.2 aO .1 a

miR-665* .2針*

1

.2. .9@.6S oo @

miR-127-5p QAno.e-sxi0o-

肾肌肉—1 6+込te 區

ph1 由ir*Pl ft①

氐43AQT 4.03.L.5

-QAQImiR-136-3pAQTuoissaidxduSSQJdxQQARFPMUOISSQJdxQQAtlEyrls.5O

心肝脾肺肾肌肉曙 miR-432-5p2

l. o.o8 4 0

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心肝脾肺肾肌肉miR-432-3p怕

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miR-136-5pJ50Io.【 増

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miR-433■E■aEIQH脾 肺 肾 肌 肉

心肝脾肺肾肌肉00*新

*最

图2 miRNA簇基因在波尔山羊体组织的相对表达量Fig. 2 Relative expression of miRNA cluster genes in Boer goats tissues体的位置相对集中，依次为miR433、miR-127-5p、 miR-432-3p/5p,最后是 miR-136-3p/5po miR-433

与miR-127-5p所处的位置有部分重叠基因位点。 通过 BLAST (http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/)比

较分析miRNA簇基因成熟序列，发现其在哺乳动物

中有较高的保守性。2.2 miRNA簇基因在山羊体组织的表达分析采用qRT-PCR方法检测波尔山羊的心、肝、脾、

肺、肾和背最长肌组织中miRNA簇基因(miR-665,

miR-127-5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR~432-5p,

miR-432-3p和miR-433 )的表达量。由图2可知，

miRNA 簇基因(miR-665, miR-127-5p, miR-136-3p,

miR-136-5p, miR-432-5p, miR-432-3 p 和 miR-433)在

山羊不同组织中均广泛表达。miR-127-5p, miR-

136-3p, miR~432-5p,miR432-3p 和 miR-433 在肌肉 中高表达,miR-136-5p和miR-665在肌肉表达量低。2.3 miRNA簇基因在C2C12细胞不同生肌时间点

的动态表达分析培养C2C12成肌细胞，分别收集增殖和分化不

同阶段的细胞样品，采用qRT-PCR分别检测在不同

生肌时间点细胞中miRNA簇基因(miR-665 , miR-

127-5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR-432-5p, miR- 432-3p和miR433)的表达模式。由图3可知,miR-

AQTuoissaidxd QAHB-SX:.25.50.75O

心'肝■脾’肺肾’肌肉fl R136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐渐增加，在培 养的第8天中表达最高。miR-127-5p,miR432-3p,

miR432-5p,miR433 和 miR-136-5p 表达量呈现先 升高后降低的趋势,miR-127-5p和miR433在增殖

与分化的第6天的表达最高；miR432-3p在增殖的 第2天与分化的第6天表达最高;miR432-5p在增

殖的第4天与分化的第8天表达最高；miR-136-5p 在增殖与分化的第2天表达最高。miR-665随

C2C12细胞增殖和分化表达逐渐降低。3讨论通常miRNA与其宿主基因转录表达的同时会

受到多种因子的调控,miRNA却往往表现出一定的 组织和时空的特异性。miR-l/miR-206 /miR-133仅

在肌肉组织中特异表达，而miR-127-3p在动物的多

个组织广泛表达，且在肌肉、皮肤和脾脏中表达较

高[6_7]o本研究采用qRT-PCR法对波尔山羊组织

中miRNA簇基因的表达量进行检测，发现miRNA

簇基因(miR-665 , miR-127-5p,miR-136-3p, miR-136- 5p, miR-432-5p, miR-432-3p 和 miR-433 )在山羊不

同组织中均广泛表达。miR-127-5p, miR-136-3p,

miR432・5p,miR~432-3p 和 miR433 在肌肉中高表 达,miR-136-5p和miR-665在肌肉表达量低。揭示17833卷0.60miR-6651A.6 211

.84

miR-127-5p計.2«

W-0.45JWCA

0.15-J3BICH0

Un02

4

Au

688

0

dill2

6..O4..5.O 3.L.5 O-s

IQAEuoSQJdxQQABSQHT miRNAs的组织表达特征,确定了 miRNA簇基因 与山羊肌肉表型的关系。骨骼肌的生长发育主要表 现为肌细胞数量的增加和体积的增大，这两方面的

顺利进行依赖于成肌细胞的增殖和分化国。miR­

NAs 在转录后水平调控基因表达，在成肌细胞增殖 和分化过程中发挥着重要的作用⑼。笔者近期研 究发现miR-127-3p表达量随C2C12肌细胞分化逐

渐增高，暗示miR-127-3p参与骨骼肌细胞分化的调

控国。体外培养C2C12成肌细胞，采用qRT-PCR

法分别检测在C2C12增殖和分化不同生肌时间点

细胞中miRNA簇基因的表达水平。研究发现miR- 136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐渐增加。 miR-127-5p, miR432-3p, miR432-5p, miR433 和

miR-136-5p表达量呈现先升高后降低，miR-665在

C2C12增殖和分化的过程中表达逐渐降低。该研究

首次确定miRNA簇基因在山羊体组织的表达水平,

并分析C2C12细胞增殖和分化阶段的动态表达模

式。本研究发现miR-127-5p在山羊组织中广泛表

达，其在增殖的C2C12细胞的表达量高于分化时 期，这与笔者等岡的研究确定miR-127-3p在山羊体 组织广泛表达，其在增殖的肌细胞的表达量高于分 化时期的结果是一致。但文献报道miR-127在桐城

Uss9jdxe■S cn4 6 80.40.3时间(d)时间(d)miR-432-5p uo-scfiQJdxQ

时间(d)129 6 3

IQAEmiR-136-5pmiR-432-3pAQTUOIS0.2 J

慎故«餐

66 4 2 0

aldxQQAIlQyrjsQApi0 2 4 8_^LI0 2 4 6 80

iiii2 4 6 8时间(d)■S讯 針WJW

AQIuogaldxQQApBpM时间(d)

图3 miRNA簇基因在C2C12细胞增殖和分化的不同阶段的相对表达量Fig. 3Relative expression of miRNA cluster genes during C2C12 myoblast proliferation and differentiation猪组织的表达高于长白猪，而且miR-127主要在胚

胎发育的中后期保持较高的表达水平,在发育的早

期和出生后表达相对低⑷o这显然不同于miR-127

在猪上的研究报道。分析原因可能是miR-127基因 在经pre-miR-127剪辑后生成两种形式的成熟的

miRNA：miR-127-3p 和 miR-127-5p,而该研究仅是

检测miR-127-5p的表达水平。miR433在肌肉组织

和C2C12细胞高表达，其与miR-127来自于同一个

重叠基因位点，暗示miR433可能也在成肌增殖与

分化过程中发挥着重要的作用。但目前研究多集中

报道miR433抑制乳腺癌增长少］,食管癌的增殖与 侵袭Z以及人骨肉瘤细胞凋亡问等医学方面。 miR432基因在经pre-miR432剪辑后生成两种形

式的成熟的 miRNA： miR432-3p 和 miR432-5p。

miR432-3p在肌肉组织高表达，在增殖的C2C12细 胞的表达量高于分化时期，暗示miR432-3p可能参

与骨骼肌肌细胞的生成,与肌肉生长发育密切相关。

这与Ma等问发现miR432在小鼠的组织与细胞的 表达是一致的。但是Ma主要分析了细胞前期中的 miR432的表达，该研究检测miR432-3p增殖与分

化过程中不同时间点的表达。miR432-5p在肌肉

组织和C2C12细胞高表达，需要进一步的深入研究 其在成肌细胞生成过程中的调控功能。miR-136-3p

1期李杰等:miRNA簇基因在山羊组织和不同时期的C2C12细胞的表达分析179

在波尔山羊肌肉组织中高表达，其表达量随着肌细

胞增殖和分化逐渐增加。Lu等[⑷高通量测序 (RNA-Seq)法分析发现在猪骨骼肌miR-136表达量 高。之前利用高通量测序(RNA-Seq)法对胚胎期和 出生的简洲大耳羊的背最长肌miRNA进行转录组

测序，发现miR-136-5p是骨骼肌高表达miRNA[15]。

该研究主要分析成年山羊miR-136-5p的表达水平，

可能是由于miR-136-5p在山羊的早期发育高表达，

而成年后表达量减少。进一步揭示了 miR-136对哺

乳动物骨骼肌的生长发育起重要作用。研究报道

miR-665抑制卵巢癌细胞的增长和迁移①],同时

MiR-665还抑制髓核细胞的增殖和基质降解

miR-665在C2C12细胞增殖和分化的过程中表达逐 渐降低。暗示可能其在C212细胞中是具有相同的

抑制作用。通过体内和体夕卜研究分析miRNA簇基因(miR

-665, miR-127-5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR-432-

5p,miR432・3p和miR433)表达模式，确定在个体

与细胞水平miRNAs的表达水平，系统阐述了 miR-

NA簇基因表现出一定的组织和时空的特异性，揭

示其对肌肉生长发育调控的分子机理，不但对将来

畜禽基因工程育种，也对人类肌肉疾病的发病机理

的研究与治疗提供参考。4结论体内组织检测发现,miRNA簇基因(miR-665,

miR-127-5p, miR-136-3p, miR-136-5p, miR-432-5p,

miR432-3p和miR433)在山羊不同组织中均广泛

表达。miR-127-5p, miR-136-3p, miR-432-5p, miR- 432-3p和miR433在肌肉中高表达,miR-136-5p和

miR-665在肌肉表达量低。体外细胞检测发现，

miR-136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐渐升高； miR-127-5p, miR-432-3p, miR~432-5p, miR-433 和

miR-136-5p表达量呈现先升高后降低的趋势;miR-

665 在随C2C12细胞增殖和分化表达逐渐降低。综

上，推测miRNA簇基因可能参与骨骼肌细胞增殖与

分化的过程。下一步将通过构建过表达、干扰载体,

转染卫星细胞或成肌细胞，系统阐述miRNA簇基因

对骨骼肌生长发育的调控功能。参考文献：[1 ] COMAI G, TAJBAKHSH S. Molecular and Cellular Regulation of

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