梭果黄芪总黄酮纯化工艺研究

’25

炮制制剂

梭果黄芪总黄酮纯化工艺研究

郭帅，夏厚林，吴强，贾芳，黄萍，唐建军，宁梓君，黄晓燕

[摘要】目的：筛选梭果黄芪总黄酮的最佳纯化工艺。方法：采用静态与动态．解吸附方法对梭果黄芪总黄酮进行纯

化，以吸附率与洗脱率等指标优化工艺，利用紫外．可见分光光度仪测定梭果黄芪总黄酮的含量。结果：x．5型大孔树脂纯化效果最好，其最佳工艺为上样液总黄酮浓度为4．05mg馏水3BV、50％乙醇6BV按1．5mL

L，上样流速为1．5mLmL～，上样量为30m

min～，分别以蒸

min’1的流速洗脱，弃去蒸馏水洗脱部分，收集50％乙醇洗脱部位。结论：该工艺操作

简单，稳定可行，重复性好，适合梭果黄芪总黄酮纯化。

[关键词】总黄酮；梭果黄芪；大孔树脂；纯化[中图分类号】R932

Study

on

[文献标识码]A[文章编号]1674—926X(2013)02—009-04

ernestii／(GUOShuai

ou—Lin．∥u,XIAH

purificationprocessoftotalflavonoidsfromAstragalusQiang,JIA

hineseMINGZi-Jun．HUANGXedicine。Fang,HUANGPtng．TANGJian—Jun．Niao-Yan)／／(ChengduUniversityofTraditionalCChengdu611137,China)

【Abstract】Obiective：To

Theoptimal

establish

a

technicalprocessforpurificationoftotalflavonoidsfromAstragalus

ernestii．Method：techniques

were

techniquesofpurificationofflavonoidwereobtainedbystaticadsorptionandelutiontests，andthe

evaluatedbymithultravioletspectrophotomeasuringtheconcentrationoftotalflavonoidsfromAstragalusernestiiweter．Result：ThebesteffectofseparationwasfoundintheexperimithX-5miththesamLentwacroporousresinwplingrate1．5mconcentration4．05mg1．5mL

min～，

Land3BVrespectivelywithdistilledwmL～．samplingsize30mater,6BV50％ethanolaccordingto

min～flowrateelution．Thedistilledwaterelutionpartswereadandoned，andcollecting50％ethanolelutionpartswere

can

collected．Conclusion：X-5resin

beappliedtopurifytotalflavonoidsfromA

stragalusernestii．

【KeywordslTotalflavonoids；Astragalusernestii；macroporousresins；purification

梭果黄芪为豆科植物Astragalus

ernestii

Comba的广泛应用。本研究选用4种不同型号大孔树脂对梭果黄芪初提取物中总黄酮进行纯化工艺研究，为进一步研究奠定基础。

干燥根。为《四川省中药材标准》2010年版收载品种，在四川地区常替代药典黄芪品种药用。性甘、温，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。临床常用于治疗气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿。现代药理研究表明，黄芪具有抗疲劳和免疫调节作用¨~3】。作者通过梭果黄芪不同部位对小鼠抗疲劳试验与小鼠免疫试验发现总黄酮部位是其有效部位之一。梭果黄芪总黄酮的纯化工艺尚未见报道，故对梭果黄芪总黄酮纯化工艺进行研究已经十分必要。大孔树脂因具有吸附容量大、吸附速度快、选

择性好、再生处理简单快速等特点，在纯化精制中

[作者单位]成都中医药大学，四川成都6111137

[作者简介]郭帅(1987．)，男，硕士研究生，主要从事中药

质量标准及物质基础方向研究Email：guoshuai82@1标准及物质基础

[收稿日期】2012．11．16

63．com

l材料

紫外一可见分光光度计uV一1100(上海天美科

学仪器有限公司)；电子分析天平(sartorius，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；梭果黄芪药材购于成都新荷花中药材市场，经成都中医药大学鉴定教研室卢先明教授鉴定为豆科植物梭果黄芪Astragalus

ernestii

Comba；大孔树脂D一101、D一301、S一8、X一5

(天津海光化工有限公司)；毛蕊异黄酮苷对照品(成都曼斯特生物制品有限公司，批号11042915，

含量>98％)；其余试剂均为分析纯。

2方法

2．1梭果黄芪总黄酮粗提液的制备

取梭果黄芪粗粉，以10倍量75％乙醇回流提取2次，每次一小时，合并乙醇提取液，回收乙醇至无醇味，加水稀释调整为每mL含生药0．5g，摇匀，即

[通讯作者】夏厚林(1964一)，男，教授，主要从事中药质量

向研究

中药与临床Pharmacy

andClinics

ateriaMedicaofChineseM

201

3；4(2)

得。

2．2总黄酮测定

2．2．1检测波长的确定精密量取对照品溶液和供试品溶液分别置10mL具塞试管中，参照紫外一可见分光光度法(中国药典2010版一部附录VA)，在200

nm～600

nm之间扫描。结果表明，对照品溶液和供

试品溶液在287nm处有最大吸收峰，故选择287nm

作为检测波长。

2．2．2毛蕊异黄酮苷标准曲线的绘制

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含

168．4

pg的溶液作为对照品溶液。精密量取对照品

溶液0．2mL、0．3

mL、0．4mL、0．5m

L、0．6mL、0．7mL、0．8

mL，分别置10mL具塞试管中，加甲醇

至7mL，摇匀。以甲醇为空白，参照紫外一可见分

光光度法(中国药典2010版一部附录VA)，在287nm处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=35．97X+0．004，r=0．9998，结果表明，毛蕊异黄酮苷在0．004811

mg．mL一～0．019246

mgmL。范围内

浓度与吸光度呈良好的线性关系。2．3梭果黄芪总黄酮含量的测定

精密量取一定量的样品液，按“2．2”操作，测定并计算总黄酮的含量。2．4大孔树脂的预处理

将D一101、D一301、S一8、x一54种树脂分别用95％

乙醇浸泡24h，使树脂和乙醇充分接触，并用玻璃棒

不断搅拌；以除去气泡；将浸泡了24h后的树脂湿

法装柱，再用95％乙醇冲洗层析柱，检测流出液，直至淋洗后流出液与水混合(1：5)后不再出现白色混浊，用大量水洗去乙醇至无醇味；依次用2倍柱体积分数为5％的HCl溶液、1倍体积蒸馏水、2倍柱体积2％的NaOH溶液淋洗柱子，最后用蒸馏水洗至洗脱液为中性。处理完毕后，抽滤，密封存放，备用。2．5大孔树脂的筛选

①静态吸附称取不同型号的干树脂1g，经预

处理后，置于150mL具塞锥形瓶中，精密加入40mL粗提液，每10m

in振摇1次，持续1h，室温下静置24h，滤过，取续滤液，按“2．2”测定总黄酮含量，计算各型号大孔树脂的吸附容量。②静态解吸附上述各型号吸附饱和的大孔树脂，分别加乙醇50mL，每

10

min振摇1次，持续1h，室温下静置24h，滤过，

取续滤液，按“2．2”测定总黄酮含量，计算各型号

大孔树脂的解吸率。计算公式：

吸附容量(t—刮g)=堂塑!旦堡堕坌塑鱼量—鱼里LaI二脂堕t堕t亘(堡g塑)堕!旦』塑塑塑墅兰曼型

解吸率c％产罨嚣氍嚣糕掣咣

2．6大孔树脂动态吸附泄漏曲线绘制

通过静态吸附与解吸附试验筛选出效能最好的树脂作为纯化梭果黄芪总黄酮的树脂。称取处理好

的x一5型干树脂1份约5g，湿法装柱，取总黄酮浓度为2．70mg．mL。1的梭果黄芪粗提取液100mL，室温下以lmL．min‘1加在树脂柱上，每10mL收集一管流出

液，检测流出液中梭果黄芪总黄酮浓度，计算树脂的吸附容量，绘制动态吸附泄漏曲线。

2．7大孔树脂柱层析纯化总黄酮的工艺参数考察

通过筛选实验，确定分离梭果黄芪总黄酮的树脂，准确称取等份经预处理的理想树脂，每份约5g，分别湿法装入具阀色谱柱中，考察上样液流速、

浓度、洗脱剂体积分数、用量等参数对纯化梭果黄芪总黄酮的影响，优化工艺。

2．8纯化倍数计算

纯化倍数纯度：壁坚冀墼墼=便碧嚣誓糕

\"mr里LgJ

100％

3结果与分析

3．1大孔树脂的筛选

不同类型大孔树脂对梭果黄芪总黄酮的吸附容量和解吸率见表1，由图1、图2可直观的对比出x一5对总黄酮有较大的吸附容量和较高的解吸率，因此选择x一5大孔树脂进行总黄酮纯化。

表1不同型号大孔树脂吸附性能比较

；|_

-l

I

1)101

^一b

S一8

D30l

l儿01

x—b

s—g

u3ul

大孔树脂类型

大孔树脂类型

图1不同型号大孔树脂吸附容量比较图2不同型号大孔树脂解吸率比较

3．2

x一5大孔树脂动态吸附泄漏曲线绘制

由图3可见，流出液中总黄酮的含量随上样量增

加而增加。上样量在10mL一50

mL吸附曲线上升缓

慢，此阶段为吸附过程；上样量超过50mL后，吸附

中药与临床Pharmacy

andClinics

ateriaMedica2013；4(2)ofChineseM

通过曲线开始上升，此时树脂柱逐渐吸附饱和。因此，为了减少泄露，在提高梭果黄芪总黄酮的收率的同时增大上样量，合适的上样量选择在50mL左右(此时总黄酮动态吸附容量约为21．69mgg。)。

划一蠖{

随口＼

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：∞

图3X一5型树脂对总黄酮动态吸附泄露曲线

3．3

x．5动态吸附总黄酮的工艺参数

3．3．1上样液浓度的优化确定最大上样药液量，既可以减少药材的损耗，又避免树脂的浪费，称取处理

好的X一5干树脂4份，每份约5g，湿法装柱，将1．35

g

mL～，2．70mg

mL一，4．05mg

mL-',5．40

mgmL‘1的

梭果黄芪总黄酮提取液各50mL分别以1mLmin。的流速通过树脂柱，室温下进行动态吸附，检测流出液中梭果黄芪总黄酮浓度，计算树脂的吸附容量，确定最佳上样浓度。由图4可知，在一定浓度范围内，随上样液质量浓度增加，x一5大孔树脂对梭果黄芪总黄酮的吸附容量先增加后减少。上样液总黄酮

质量浓度在4．05mgmL’1时吸附容量最高。

篓蔷

口rr\"o

萎皿唧

上样液总黄酮浓度(mg／m1)

图4上样液浓度对总黄酮吸附容量的影响

3．3．2上样液流速的优化称取处理好的x一5干树脂4份，每份约5g，湿法装柱，将总黄酮浓度为4．05

mg．mL一的梭果黄芪总黄酮提取液各30m

L分别以1mL

篓鐾菩

3

嚣删

上样液流速(ml／min)

图5上样液流速对总黄酮吸附容量的影响

min～，1．5mL

min～，2mL

min～，2．5

mLmin。1的流速

通过树脂柱，室温下进行动态吸附，检测流出液中梭果黄芪总黄酮浓度，计算树脂的吸附容量，确定

最佳上样流速。由图5可知，综合考虑时耗，吸附容

量，控制上样流速为1．5mLmin。1较适宜。

3．4

x一5树脂动态解吸附的工艺参数优化

3．4．1洗脱溶媒的考察称取处理好的X．5干树脂1份，约5g，湿法装柱，精密吸取总黄酮浓度为4．05mg

mL。1的梭果黄芪总黄酮提取液30m

L，室温下以1．5mL．min。的流速加在树脂柱上，依次用水，30％，50％，70％，95％乙醇(用量均为4BV)，洗

脱流速为1．5mLmin～，每1BV收集一份洗脱液，测

定每份洗脱液中总黄酮，计算洗脱率。以收集流份数为横坐标，洗脱率为纵坐标，分别绘制总黄酮的洗脱率．收集份数曲线图。由图6可知，30％乙醇、50％乙醇洗脱部位为总黄酮主要存在部位，故确定50％乙醇作为总黄酮洗脱溶剂；蒸馏水洗脱部位未检测出总黄酮，说明蒸馏水可达到除杂目的，故采用蒸馏水除杂。

2015

婪，、。。露芑。

0

6

ll

16

21

收集份数

图6总黄酮洗脱率一收集份数曲线图

3．4．2洗脱剂用量的考察按上述确定的洗脱溶媒条

件，取梭果黄芪上柱液30mL上柱，用水洗脱3BV

后，换用50％乙醇洗脱，控制流速洗脱流速为1．5mL．min～，每个树脂床体积收集1份，分别测定各流份的总黄酮量，计算洗脱率，以收集流份数为横

坐标，洗脱率为纵坐标，分别绘制总黄酮的洗脱率-收集份数曲线图，确定最佳洗脱剂用量。由图7可知，50％乙醇洗脱用量至6BV时，总黄酮已基本被解吸附，用量至7BV时，总黄酮的洗脱率已较低，为0．77％，故确定50％L醇的洗脱用量为6BV，收集50％乙醇洗脱部位。

图7总黄酮洗脱率一收集份

曲线图

m28

e坊ca2013；4(2)ateriaM中药与临床PharmacyandClinicsofChineseM

据文献报道[4曲】，梭果黄芪黄酮类成分主要为异黄烷、异黄酮及紫檀烷型，其母核上不具备3．OH或5．OH，因此不能采用以芦丁为对照品，与铝离子螯合显色的方法测定总黄酮含量，综合考虑其黄酮类成分结构式及市场现有对照品情况，采用梭果黄芪中所含的毛蕊异黄酮苷为对照品进行含量测定。

参考文献

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学学报，2003，24(17)：201．

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用[J]．世界中西医结合杂志，2007，2(6)：335．

4工艺验证试验

以梭果黄芪作为实验药材，按优化工艺条件进行提取，取梭果黄芪总黄酮提取液(总黄酮浓度为

4．0530

gmL。)mL-1,毛蕊异黄酮苷浓度为0．061m

mL，以1．5mL。min‘1的流速上样，依次用蒸馏mg

mL

水3BV、50％乙醇6BV洗脱，洗脱流速为1．5

min～，收集洗脱液测定洗脱部位中总黄酮的含量，计算纯度和纯化倍数。50％乙醇洗脱液部位为总黄酮主要富集部位，经大孔树脂纯化后，总黄酮的纯化倍数均达到3倍以上，纯化效果好。

5讨论

本试验结果表明：x一5型树脂适合梭果黄芪总黄酮的纯化；最佳纯化工艺为上样液总黄酮浓度为

4．05

[3]梁仁哲，贺永贵，尹明浩，等．黄芪水提液对小鼠的抗疲劳作用

研究[J]．陕西中医，2009，30(4)：500．

[4】SunLi-Man，WangXiao-Ling，DengWen—Long，et

ConstituentsfromAstragalusNaturalMedicines，201

a1．ChemicalJournalof

L，上样流速为1．5mg．mL～，上样量为30m

emestii[J]．Chinese

mL

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Lmin-1'分别以蒸馏水3BV、50％乙醇6BV按1．5m

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【6】王金兰，许红梅，李卫宏．兴安黄芪化学成分研究[J1．中国中药

杂志，2008，33(4)：414．

(责任编辑：李芸霞)

min。的流速洗脱，弃去蒸馏水洗脱部分，收集50％乙醇洗脱部位。纯化后总黄酮的纯化倍数达N3倍以

匕。

(上接第5页)

：98．6(C-1)，94．o(c-1’)，78．5(C一5)，78．3(C-57)，76．6(C-3)，75．2(c3’)，74．2(C一2)，73．5(c一2’)，72．4(C一4)，71．9(C一47)，63．0(c-6)，62．8(c-67)。综合以上

得进一步研究。本文从块根紫金牛中分离得到了六个化合物，为继续研究该药抗肿瘤药效物质基础及质量标准的制定奠定了基础。

参考文献

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FE．Resorcinol

derivativesfromArdisia

数据，并与文献【6】对照，鉴定该化合物为麦芽糖。

化合物Ⅵ：白色粒状结晶，mp

183．185℃，

Molish反应呈阳性；1H—NMR(600MHz，C，D，N)：6．20(d，J=3．7HZ)，5．05(t，J=7．8HZ)，5．OO(d，J=7．8Hz)，4．76(m)，4．67(t，J=9．0Hz)，4．50(m)，4．33(m)，4．21(t，J=9．6Hz)，4．17(dd)；”CNMR(150MHz，C5D5N)：106．7(C一2，)，94．4(C—1)，85．2(c-5’)，80．8(c一37)，76．5(c一4’)，75．9(C一3)，75．8(c一5)，74．3(c一2)，72．7(C4)，65．6(C一67)，63．8(c．1’)，63．3(c．6)。综合以上数据，

并与文献[71对照，鉴定该化合物为蔗糖。

maculosa[J]．JournalofAsianNaturalProductsResearch，2007，

4讨论

据文献报道紫金牛属间苯二酚烯基衍生物是活性较好的一类化合物，其中的紫金牛酚I，紫金牛酚Ⅱ等化合物都具有抗结核活性；本文中分离得到的化合物Ⅲ，Ⅳ是间苯二酚烯基衍生物，其活性值

[6】常晓丽，马冰如，单敬文，等．狗枣猕猴桃叶化学成分研究[J】．

中草药，1996，27(7)：395．[7]Yun

Zhao，Jin-LanRuan，Jin—Hui

Wang，et

a1．Chemical

Product

constituentsofradixRanunculus

ternati[J]，Natural

Research，2008，22(3)：233．

(责任编辑：胡慧玲)