光源与照明
2019年第1期
水溶性Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点
的制备及其应用研究
苏丹璐郭睿倩张万路
(上海200433)复旦大学电光源研究所
摘要：Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点具有吸光系数高、激发光谱宽、发射光谱灵活可调等特点，且不含有毒重金属元素，近年来受到广泛关注。相较于传统的有机溶剂合成方法，水相合成法操作简单、成本低廉，且制备的量子点具有更好的生物相容性，因此在生物医学领域具有广阔的应用前景。文章阐述了Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点的水相制备方法及其相关机理，并介绍了其在离子和生物分子检测、生物荧光标记以及生物成像等方面的应用研究进展。
关键词：合金量子点；水相合成；荧光调谐；荧光探针；生物成像
0引言
量子点(QuantumDots,简称QDs)是指三维尺
寸都为1~10nm的纳米材料。近年来，以CdSe(S/Te)为代表的Ⅱ-Ⅵ族量子点的合成及应用研究发展得最为成熟，而Cd的毒性制约了量子点在生物领域的应用[1]
。Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点所含元素毒性较低，更加环境友好，可以作为替代Ⅱ-Ⅵ族元素的材料[2]。这种三元纳米材料大多具有黄铜矿结构，同时可以通过改变组分含量调控量子点的荧光特性，其发射光谱可以实现紫外到红外的全覆盖，且荧光寿命长，因此近年来得到广泛的关注[3-5]。
目前制备量子点的方法可分为有机合成和水相合成两大类，比起有机合成法，水相法操作简便，成本低廉，更适用于生物医药等方面的应用。文章概述了Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族多元合金量子点的水相合成方法及其在离子检测、生物荧光标记和细胞成像等领域的应用。1Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点的水相制备及机理探究
Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点包含一系列多元合金量子点，如AgInS2、CuInS2、CuInSe2等。2004年，Castro课题组[6]
最先报道了三元黄铜矿CuInS2量子点的胶体制备方法，使用热分解法，采用(PPh3)2CuIn(SEt)4作为单一前驱体，溶于己硫醇溶剂中，在200℃条件下分解生成CuInS2量子点，该量子点粒径分布在2~4nm，荧光发射峰可在662~673nm调谐。由有机金属盐溶于有机溶剂中反应生成的量子点具有疏水特性，因此不适于生物相关的应用。虽然可以通过表面修饰对量子点进行相转换，使其能够溶于水，但操作十分复杂，且通常会导致荧光量子产率和稳定性的下降[7]。因此，直接在水中合成Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点的方法开始受到广泛关
注，其中研究最多的是Ag-In-S和Cu-In-S量子点。1.1水溶性Ag-In-S合金量子点的制备及机理探究
2012年，Luo课题组[8]首次报道了在水相中制备AgInS2和AgInS2/ZnS核壳结构量子点的方法，采用一锅法(热回流法)，以谷胱甘肽(GSH)为稳定剂，制备出的AgInS2量子点没有明显的激子吸收峰，荧光发射光谱半高宽FWHM>100nm，且Stokes位移达到约1.44eV，说明该量子点的荧光发射机制并不是带隙跃迁，而是带隙内缺陷态能级的施主-受主复合，如图1所示。通过包覆ZnS壳层可以将量子产率从3%提高至15%，同时导致荧光发射峰的蓝移，这是由于Zn2+扩散进入其晶格结构，导致禁带宽度增加，施主-受主间的距离也随之增加，电子跃迁释放的能量升高。
图1AgInS2量子点荧光发射机理示意图
[8]
Regulacio等[5]同样采用一锅法，以聚丙烯酸(PAA)和甲基丙烯酸(MAA)作为双稳定剂，成功合成出AgInS2/ZnS量子点，其量子产率达到20%，荧光寿命可达170ns。通过改变Ag+和In3+的比例，可以实现525~640nm的荧光波长调谐，如图2所示。随着
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Ag元素的增加，荧光发射峰值产生红移，这是因为AgInS2的最高价带是由S的3p轨道和Ag的4d轨道杂化而成的[9]，由Ag引入的轨道数增多会导致价带顶部升高，从而使材料的禁带宽度变窄。另外，双稳定剂的使用可以调节两种阳离子的反应活性，根据Pearson的HSAB理论[10]，MAA中的硫醇基团是一种软碱，更易与作为软酸的Ag+结合，而含有多个羧基的PAA则更易与In3+这类硬酸发生反应，同时可以保证反应生成物在水中有很好的稳定性。
(a)
(b)
图2不同Ag/In比例的AgInS2-ZnS量子点(a)荧光发射图谱以及
(b)受自然光照射(上)和紫外激发(下)的图像[5]
Song等[11]采用水热法，以L-半胱氨酸为稳定剂，在110℃条件下合成Zn:AgIn5S8/ZnS量子点，其量子产率达到35%。通过控制Ag/Zn比例，可以实现560~650nm荧光波长调谐。
除了传统的一锅法、水热法以外，微波辅助水相合成法可以看作水相法的改良，具有反应迅速高效、加热均匀等优点。Xiong等[7]采用微波辅助法成功制备AgInS2/ZnS量子点，反应时间由几小时缩短至10min，量子产率高达40%，荧光寿命超过400ns，且具有很低的生物毒性，有望作为生物探针应用。
1.2水溶性Cu-In-S合金量子点的制备及机理探究
与Ag-In-S量子点相比，Cu-In-S量子点水相合成
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方法的研究最早出现于相似的时间，但发展更快。2012年，Liu等[12]首先采用水热法，以巯基丙酸(MPA)为稳定剂，在150℃条件下反应21h得到具有黄铜矿结构的CuInS2三元合金量子点，产生近红外的荧光发射，但量子产率仅为3.3%。
一年后，Chen等[13]报道了采用一锅回流法95℃反应40min制备水溶性Cu-In-S/ZnS核壳结构量子点的方法。文章提出，在水相合成Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点的过程中最重要的是避免阳离子的相分离，GSH、MPA等含有巯基(-SH)的分子都只能在反应中提供软碱官能团，无法对作为硬酸的In3+起到很好的稳定作用，因此采用GSH和柠檬酸钠作为双稳定剂来控制两种不同阳离子的反应活性，并通过包覆三层ZnS壳层，使该量子点量子产率达到38%。如图3所示，通过提高Cu/In摩尔比可以使量子点吸收和荧光发射都产生红移，从而实现543~625nm的荧光波长调谐。2015年，Zhang等[14]又用同样的方法合成了Zn-Cu-In-S/ZnS四元合金量子点，发现随着Zn的加入，量子点的荧光发射波长可从709nm蓝移至594nm，光谱半高宽由158nm减小至105nm，并且由EDS表征得到的Cu/In比例下降，说明Zn2+更倾向于取代结构中的Cu+而不是In3+，这是因为Cu-S键比In-S键更弱。
(a)紫外-可见吸收光谱
(b)荧光发射光谱
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(c)紫外激发下的图像
[13]
图3
不同Cu/In摩尔比的Cu-In-S/ZnS核壳量子点
微波辅助法对于CuInS2量子点合成同样适用且高效，Xiong等[15]通过微波水相法反应10min制得CuInS2/ZnS量子点，可实现470~640nm范围内的荧光发射，量子产率达24%。通过XPS分析证明了Cu-In-S量子点中的Cu元素为+1价，这是由于前驱体中的Cu2+在反应过程中被稳定剂还原了。
为了便于应用，Chen等[16]又在2014年报道了低成本大规模量产Cu-In-S/ZnS核壳量子点的方法。采用家用的电压力锅，并以廉价的巯基乙酸(TGA)和柠檬酸钠为稳定剂，一次可制备出3g量子点，荧光波长范围545~610nm，量子产率高达40%，可以满足生物荧光标记等应用的需求。2水溶性Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点的应用
由于水溶性的Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点不含有毒重金属元素，有很好的生物相容性，且便于实现可见光-近红外的荧光波长调谐，因此在离子和生物大分子检测、生物荧光标记和成像等方面具有广阔的应用前景。2.1生物化学传感器
水溶液中的量子点会受到周围溶液中分子或离子的影响产生荧光强度的变化，利用这一特性，可以做成化学传感器。如果对其进行一定表面修饰，可以应用于生物血液中某种离子或者生物大分子的灵敏检测。
Liu等[17]发现CuInS2量子点遇到Cu2+会发生不可逆的荧光淬灭，这是因为Cu2+会在量子点的表面反应生成CuS沉淀，造成量子点中S元素的缺失。同时，这种合金量子点遇到Cd2+会发生明显的荧光增强，因为CuInS2量子点与CdS量子点具有相似的结构，Cd2+的加入会在CuInS2量子点表面形成一层宽禁带的CdS壳层，对量子点表面起到修饰缺陷的作用。在被Cd2+修饰之后，该量子点对Cu2+会更加敏感，其反应过程如图4所示。
Xiong等[7]发现溶液中的Cu2+也会使CuInS2/ZnS量子点发生荧光淬灭，这是因为Cu2+会取代量子点表面的Zn2+从而生成CuS，加速电子-空穴对的非辐射复合，而生物组织液中的其他离子如Ca2+、Mg2+、Fe2+、
Fe3+等并不会导致这样的现象。利用这一特性，可以对生物细胞内Cu2+浓度进行检测，从而应用于医学病理检测。他们又将人的白介素抗体修饰在CuInS2/ZnS量子点表面，使其可以对白介素(IL-6)进行特异性识别，从而制成生物探针，实现对癌症及其他一些疾病的荧光免疫分析，检测机理如图5所示
[15]
。
图4CuInS[17]
2量子点应用于Cu2+和Cd2+离子检测示意图
图5
IL-6的荧光免疫分析机理示意图
[15]
2015年，Lin等[18]将近红外发光的CuInS2量子点用Zn2+激活，使其表面带上正电荷，再加入带负电的凝血酶适配体(TBA)，量子点会发生荧光淬灭。然而，凝血酶(thrombin)与其适配体之间存在特异性识别作用，两者反应可生成结构稳定的化合物，使量子点荧光恢复，其机理如图6(a)所示，从而实现对凝血酶的高选择性和高灵敏度的检测。实验证明，这种方法可以在人的血清环境中实现对凝血酶的灵敏检测，而不受血清中其他生物大分子的干扰，实验结果如图6(b)所示，有望应用于与凝血异常相关的疾病诊断中。
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(a)
(b)
图6(a)Zn2+
激活的CuInS2量子点用于检测凝血酶的反应机理；
(b)CuInS2QDs-Zn(II)-TBA探针用血清中不同的生物大分子
处理结果[18]
2.2生物荧光标记与成像
由于量子点尺寸小，可以通过细胞的吞噬作用进入细胞，并且细胞毒性很低，不会影响生物的正常代谢，因此能够作为一种荧光探针应用于细胞标记和成像。由于其优异的生物相容性，可以在其表面修饰上多肽、蛋白质和抗体等特定的生物大分子，从而对癌细胞进行靶向识别，在疾病诊断和治疗中有广阔的应用前景[19-23]。
2012年，Chang等[19]通过在AgInS2/ZnS量子点表面修饰叶酸分子，实现对人肝癌(HepG2)细胞的特异性识别，并发现其对细胞质和细胞核都可以染色。2015年，Song等[11]证明通过氨基与量子点表面配体中羧基的脱水缩合反应能将甲种胎儿球蛋白(AFP)抗体与Zn掺杂的AgIn5S8/ZnS量子点相联结，同样可以实现对HepG2细胞进行特异性识别，对其细胞质进行黄色荧光标记，实现细胞级别的靶向识别和细胞成像，有望应用于肝癌的临床诊断和治疗。一年后，Yang等[20]用同样的方法制备了CuInS2-ZnS-AFP肝癌荧光探针，荧光标记结果如图7所示。
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(a)(b)
(c)
(d)
图7
HepG2细胞与CuInS2-ZnS-AFPprobe共同培养(0.24mg/mL,40min)后的显微图像
(a)亮视场；(b)暗视场；(c)被DAPI染料染色后加蓝-黄双色滤光
片；(d)被DAPI染料染色后加蓝色滤光片[20]
Regulacio等[5]利用量子点表面配体的负电性，将
尾部带正电的杆状病毒载体与AgInS2/ZnS量子点结合，实现对HeLa细胞的荧光标记，如图8所示。
(a)
(b)
图8
用AgInS2/ZnS量子点标记杆状病毒载体并传输进入
HeLa细胞的(a)示意图和(b)荧光图像[5
]
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Wang等[21]用聚乙烯亚胺(PEI)对AgInS2量子点进行包覆，实现对HeLa细胞进行标记，同时发现量子点的荧光强度会在遇到H2O2和葡萄糖时发生下降，并且下降程度与浓度呈线性关系，因此可以实现生物成像和活体细胞中H2O2、葡萄糖分子检测双功能。2015年，Yang等[22]同样用PEI对AgInS2/ZnS量子点进行表面修饰，制备出ZAIS@PEI量子点作为自示踪的基因载体，可以对基因工程所用的质粒进行荧光标记，在基因转染的过程中进行实时的追踪检测，其过程如图9所示。实验表明其对HeLa细胞的转染效率达到40%，并且生物毒性低到可以忽略，有望作为一种新的基因载体。
2016年，Arshad等[23]将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽修饰在发红光的CuInS2量子点表面，利用RGD肽对癌细胞表面过度表达的3蛋白的靶向识别，从而实现对癌细胞的特异性荧光标记，可以作为特异性的荧光探针用于癌症的临床诊断。
图9
ZAIS@PEI量子点的合成和细胞标记过程
[22]
目前，量子产率最高的黄色和橙色荧光量子点可被方便地应用于生物体外的化学物质检测和细胞成像，但是应用到生物体内标记和成像时，可见光存在一定限制，因为生物组织本身会对光产生吸收和散射作用，使标记的可见光荧光强度减弱，从而无法在生物组织中达到理想的渗透深度。同时，某些生物分子自身也会产生荧光，对光信号产生干扰
[24]
。生物组织光吸收
和自身荧光发射强度最低值处于近红外波段，因此600~950nm的荧光是用于生物体内荧光标记和成像最合适的选择
[25]
。Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点的荧光波长调谐性
能优异，且与有机染料相比更加稳定，不易产生荧光
漂白，因此有很大的应用潜力，越来越多的研究开始关注近红外波段的Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点的水相制备和生物成像应用[12,16,26-27]。2017年，Zhu等[27]用麦胚凝集素(WGA)修饰荧光发射波长650nm左右的Cu-In-S/ZnS量子点，实现对CAL-27(舌鳞癌)细胞的近红外标记，结果如图10所示。
(a)(b)(c)
(d)
(e)(f)
图10
CAL-27(舌鳞癌)细胞的(a,d)亮视场图像(b,e)荧光
图像和(c,f)混合图像；(a-c)与Cu-In-S/ZnS量子点共同培养后；
(d-f)与WGA修饰的Cu-In-S/ZnS量子点共同培养后[27]
3总结与展望
水溶性Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点由于荧光波长便于调谐、稳定性好、生物毒性低等特点，近年来得到广泛研究，特别是关于Ag-In-S和Cu-In-S量子点的研究
进展比较迅速，目前已初步实现低成本量产，且最高量子产率达到40%左右。通过表面修饰特定的生物分子，可以实现生物体外的病理监测。今后，该量子点的发展还面临着以下挑战：(1)Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子点合成过程中的生长动力学及其荧光机理还需要更深入的研究，以进一步降低成本，提高量子产率，特别是在600~950nm波段的荧光量子产率；(2)目前对应用于生物特异性标记的表面修饰方法的研究还很不系统，
需要开发标记某一类细胞(如癌细胞)的通用技术；(3)对于水相直接合成的Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子点，目前的生物应用研究还停留在体外实验的阶段，下一步需要增加生物活体成像的研究，以进一步拓展其应用范围，为医学临床诊断和治疗提供新的思路。
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