维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年８月 中国实验动物学报 ＡＣＴＡ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＵＭ ＡＮＩＭＡＬＩＳ ＳＣＩＥＮＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ Ａｕｇｕｓｔ，２００７ Ｖｏ１．１５ Ｎｏ．４ ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝一 第ｌ５卷第４期 防防 研究报告 、 ； ｅ １ ７１３一雌二醇对剑尾鱼卵黄蛋白原的诱导研究 温茹淑 ，方展强 ，江世贵 ，马广智 ，徐杰 （１．华南师范大学生命科学学院，广州５１０６３１；２．农业部渔业生态环境重点开放实验室， 广东省渔业生态环境重点实验室，中国水产科学研究院南海水产研究所，广州 ５１０３００； ３．嘉应学院生物系，梅州５１４０１５） 【摘要】 目的研究１７ｔ３－雌二醇（Ｅ２）暴露对雄性剑尾鱼（ ７ Ｍ ｈｅｌｌｅｒｉ）卵黄蛋白原（ｖｉｔｅＨｏｇｅｎｉｎ，Ｖｔｇ）诱 导作用作为环境风险评价（ＥＲＡ）的有效生物学标记的可行性。方法 以Ｅ２诱导的剑尾鱼雄性个体的整体匀浆液 为材料，采用Ｓｅｐｈａｅｒｙｌ Ｓ－３００凝胶过滤层析柱和Ｑ Ｓｅｐｈａｏｓｒｅ阴离子交换柱从剑尾鱼体内提纯Ｖｔｇ。结果确定了被 纯化的剑尾鱼Ｖｔｇ在４％一７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳中相对分子质量为５４０×１０３。４％一７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳后的 凝胶分别利用苏丹黑Ｂ进行脂蛋白染色、高碘酸．Ｓｃｈｉｆ试剂进行糖蛋白染色和甲基绿进行磷蛋白染色，表明剑尾鱼 Ｖｔｇ是一种富含糖、脂、磷的蛋白。结论有效生物学标记。 表明雄性剑尾鱼卵黄蛋白原的诱导变化可作为环境风险评价（ＥＲＡ）的 【关键词】剑尾鱼；卵黄蛋白原；提纯；环境风险评价 【中图分类号】Ｑ１７６ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１００５．４８４７（２００７）０４．０２８０．０５ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｂｙ １７一Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｉｎ Ｓｗｏｒｄｔａｉｌ Ｆｉｓｈ（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ ｈｅｌｌｅｒｉ） ＷＥＮ Ｒｕ．ｓｈｕ ～，ＦＡＮＧ Ｚｈａｎ．ｑｉａｎｇ ，ＪＩＡＮＧ Ｓｈｉ．ｇｕｉ ，ＭＡ Ｇｕａｎｇ．ｚｈｉ ，ＸＵ Ｊｉｅ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３１。Ｃｈｉｎａ； ２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｍｉｎｉｓｔｙ ｏｆ ｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＦＳ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３００，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｙｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｅｉｚｈｏｕ ５１４０１５，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｉｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ（Ｖｔｇ）ｂｙ １７ １３・ｅｓｔｍｄｉｏｌ ｉｎ ｍａｌｅ ｓｗｏｒｄｔａｉｌ ｉｆｓｈ（ 脚 ｎ ｈｅｌｌｅｒｉ）ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｖａｌｉｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔｒｌ ｒａｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＥＲＡ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｔｇ Ｗａｓ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ（ＷＢＨ）ｏｆ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ・１７ １３ ｔｒｅａｔｅｄ（１０ ｋｔｇ／ｍＬ ａｍｂｉｅｎｔ ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ｆｏｒ ２１ ｄａｙｓ）ｍａｌｅ ｓｗｏｒｄｔａｉｌ ｆｉｓｈ ｂｙ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ （Ｓｃｐｈａｅｒｙｌ Ｓ－３００）ａｎｄ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｑ Ｓｃｐｈａｒｏｓｅ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｖｔｇ ａｐｐｅａｒｅｄ ｔｏ ｅｘｉｓｔ ａｓ ａ ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ５４０×１０３ ｉｎ ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）．Ｖｔｇ Ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｓ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｇｌｙｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ ａｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｌｓ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ，ｆｏｒ ｌｉｐｉｄｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｄａｎ ｂｌａｃｋ Ｂ，ａｎｄ ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ・Ｓｃｈｉｆ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｉｔ ａｌｓｏ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｓｅｍｂｌｅｄ ｔｈｅ Ｖｔｇ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｔｅｌｅｏｓｔ ｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｒｅａｓｏｎａｂｌｙ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ａｆｓ ｓｗｏｒｄｔａｉｌ ｆｉｓｈ Ｖｔｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｖｔｇ ｉｎ ｍａｌｅ ｓｗｏｒｄｔａｉｌ ｉｆｓｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ａ ｖａｌｉｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔｒｌ ｒａｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＥＲＡ）． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｓｗｏｒｄｔａｉｌ ｆｉｓｈ（脚７ Ｍ ｈｅｌｌｅｒｉ）；Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ；Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ；Ｅｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔｌａ ｉｒｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ 环境雌激素（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｓｔｒｏｇｅｎ）对人类和 野生动物的有害效应己引起人们的广泛关注。由于 环境中环境雌激素的含量极低，虽然使用化学分析 的方法可以检测，但是其方法繁琐且费用成本较高， ［基金项目］农业部渔业生态环境重点开放实验室开放基金和 广东省渔业生态环境重点实验室开放基金项目（２００５—９）；广东省科 技计划项目（编号：２００４Ｂ４０１０１０１５）资助。 因而目前使用生物标志物快速检测环境雌激素的方 法已经得到许多学者的推崇。近年来，许多研究人 员开始着手建立潜在环境雌激素的筛选方法。目 ［作者简介］温茹淑（１９７４一），女，硕士；研究方向为水生态毒理 学。 ［通讯作者］方展强；Ｅｍａｉｌ：ｆａｎｇｚｈｑ＠ｓｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃａ 前，己有多种筛选方法得以应用。鱼类终生生活在 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国实验动物学报２００７年８月第ｌ５卷第４期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｕｇｕｓｔ，２００７，Ｖｏ１．１５．Ｎｏ．４ ２８１ 水中，对水环境中的污染物十分敏感，因而已经成为 监测环境雌激素的理想实验动物。通常情况下卵黄 蛋白原（ｖｉｔｅ１１０ｇｅｎｉｎ，Ｖｔｇ）存在于性成熟雌性硬骨鱼 类的血液中，在雄鱼和未成熟的雌鱼体内不存在或 仅有极微量存在ｎ ，但在外界雌激素或雌激素类 似物的诱导下鱼类肝脏也能大量产生Ｖｔｇ 。因 此作为雌激素的诱导产物，Ｖｔｇ可以作为在外界雌 激素或其他内分泌干扰物作用下的鱼类体内的一种 生物指标蛋白。建立在鱼类的卵黄蛋白原（Ｖｔｇ）水 平的筛选方法，因其特异性，已受到高度重视。 剑尾鱼（Ｘｉｐｈｏｐｈｏ￣ｈｅＵｅｒｉ）是一种热带淡水小 型鱼类，由于体型小、繁殖周期短，易饲养，可在实验 室条件下进行纯化培育；又因其对某些有机物或重 金属敏感，已被推荐作为生态毒理学测试的理想实 验动物 ＿７＿，但是迄今为止以它作为实验动物检测 环境雌激素的研究尚未报道。本课题通过研究１７ｐ． 雌二醇（Ｅ’）暴露对雄性剑尾鱼（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ ｈｅｌｌｅｒｉ）卵黄蛋白原（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ，Ｖｔｇ）诱导作用评估 作为环境风险评价（ＥＲＡ）的有效生物学标记的可 行性 １材料与方法 １．１药品与仪器 所使用的药品１７ｐ雌二醇（Ｅ：）购自Ｓｉｇｍａ公 司，丙烯酰胺和Ｎ，Ｎ’甲叉双丙烯酰胺购自Ｐｒｏｍｅｇａ 和天象人生物有限公司，高相对分子质量标准蛋白 和次高相对分子质量标准蛋白购自Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ和上海生物化学研究所。使用北京六一 仪器厂的ＤＹＹ ｌｌＩ．５型电泳仪和ＤＹＹ ｌｌＩ．２８Ａ电泳 槽，瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司的全自动快速蛋白质液相色 谱仪（ＦＰＬＣ），上海第三分析仪器厂的７５２紫外光栅 分光光度计及ＶＩＢＥＲ ＬＯＵＲＭＡＩ全自动凝胶成像分 析系统。 １．２实验动物 实验用的剑尾鱼由珠江水产研究所李凯彬工程 师惠赠，是同批孵化的性成熟雌、雄个体，体长为 ４．３５±０．５ ａｍ，体重为１．６±０．６ ｇ。取回后在水族箱 （４５ ａｍ×３０ ａｍ×２５ ａｍ，加入水体积为２０ Ｌ）暂养 ２周后进行卵黄蛋白原诱导实验。实验过程中２ ｄ 换水１次，实验用水为连续曝气２４ ｈ的自来水，水 温（２２±２）℃，ｐＨ为６．８，硬度为２．４度（德国度）。 饲料由珠江水产研究所提供，每天投喂２次。每组 均用同样管径的气头连续充气。 １．３卵黄蛋白原诱导实验 卵黄蛋白原（Ｖｔｇ）诱导实验设１个雄鱼空白对 照组、１个雌鱼空白对照组，一个暴露于等体积混合 液水体的雄鱼对照组及３个不同浓度的雄鱼试验 组，每组投入实验鱼２０尾。采用水体暴露的方法进 行诱导，先用丙酮溶解配成１ ｍｇ／ｍＬ的母液后，每次 换水时按不同的浓度将母液加入水中。使３个处理 组水体中的最终浓度分别为：１、１０、５０ ｇｇ／Ｌ，对照组 加入同等体积的丙酮。诱导时间为２１ ｄ。 诱导实验结束，进行剑尾鱼整体匀浆液的制备。 取雄性剑尾鱼，先测量体重、体长，将对照组和实验 组的个体分组，每一尾鱼用研钵研碎，加入２倍鱼体 重量的４℃预冷的匀浆缓冲液，在４℃下，１０ ０００ ｒ／ ｍｉｎ，离心３０ ｍｉｎ。上清液用滤器过滤后用于层析或 保存在一８０℃备用。 １．４卵黄蛋白原提纯 用全自动快速蛋白质液相色谱仪（ＦＰＬＣ）分２ 步进行层析，整个过程温度控制在４℃。 １．４．１第一步用凝胶过滤层析：样品共２个，分别 为经１７ｐ雌二醇诱导雄鱼的匀浆液和未经１７ｐ雌二 醇诱导雄鱼的匀浆液。柱子填料为：Ｓｅｐｈａｃ￣ｌＳ．３００ ＨＲ，柱子体积为１４０ ｍＬ，柱直径为１．６ ａｍ，高度为７０ ａｍ，缓冲液为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ．ＨＣ１（含１ ｍｍｏｌ ＰＭＳＦ， ｐＨ ８．０）。２个样品所设定的层析条件相同，上样前 先平衡１．５个柱体积再上样，上样量为２ ｍＬ，洗脱 １．５个柱体积。流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ下洗脱；检测器波 长２８０ ｎｍ，蛋白组分收集用１ ｍＬ的离心管收集，将 洗脱曲线上出现的各峰所对应的洗脱样品收集，并 进行４％～７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳检测，同时将所 得洗脱峰型和对照（未经诱导雄鱼的匀浆液）的洗 脱峰作对比，分析哪一个洗脱峰可能包含有Ｖｔｇ蛋 白。将可能含有Ｖｔｇ蛋白的洗脱峰收集，在一８０℃ 下保存备用。 １．４．２第二步阴离子交换层析：将凝胶过滤层析后 的蛋白组分别用于阴离子交换层析，柱子的填料为 Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），柱子体积为１４０ ｍＬ，柱直径为２．６ ａｍ，高度为１４ ｃｍ。缓冲液Ａ为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（含１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ，ｐＨ ８．０），缓冲液 Ｂ为缓冲液Ａ＋１ ｍｏｌ ＮａＣ１。流速为６ ｍＬ／ｍｉｎ，样 品进行０～１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１梯度线性洗脱。设定层析方 法：上样前平衡０．５倍柱体积，上样１１ ｍＬ，用２倍柱 体积缓冲液Ａ把未结合在柱子上的蛋白洗脱下来， 然后０～１ｍｏＹＬ ＮａＣ１梯度线性洗脱５个柱体积，再 维普资讯 http://www.cqvip.com ２８２ 中国实验动物学报２００７年８月第１５卷第４期 Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｕｇｕｓｔ，２００７，Ｖｏｌ・１５・Ｎｏ・４ 用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ再洗脱２个柱体积。在检测器波长 ２８０ ｎｍ，每５ ｍＬ进行收集。洗脱的各峰蛋白在４％ ～７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳中检测Ｖｔｇ相对分子质量 及其纯度。 １．５卵黄蛋白原纯度和相对分子质量鉴定 通过４％～７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳来鉴定Ｖｔｇ 的纯度，待测样品和标准蛋白均分别加入等体积的 Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳指示剂，混匀后即可上样。每个泳 道加入２５ 的样品缓冲溶液，样品与上样缓冲液 以１：１混合，上样缓冲液为４０％的蔗糖加少量的溴 酚蓝。ｍａｒｋｅｒ采用Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司的Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ高 相对分子质量标准试剂盒为标记以鉴定Ｖｔｇ的纯度 及相对分子质量。电泳起始电压为１２０ Ｖ，待溴酚 蓝前沿进入分离胶后调整电压为２００ Ｖ，当前沿跑 至底部后再跑１～２ ｈ停止电泳。取出凝胶放入考 马斯亮蓝Ｒ一一日口ｏｊ田目目０∞ 葛８曩七２ 《 ２５０染色液中染色２ ｈ左右，再用脱色液 （１０％乙酸）脱色。 １．６卵黄蛋白原含糖、磷、脂特性的鉴定 对Ｖｔｇ做Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ凝胶电泳，胶浓度为４％ ～７．５％的分离胶和４％的浓缩胶，将同一块胶分成 四份切下来，分别进行考马斯亮蓝染色，糖蛋白染 色、脂蛋白染色、磷蛋白染色。糖蛋白和磷蛋白的检 测参照Ｓｕｎ的方法 ；脂蛋白的检测参照杨安钢 等 方法进行。 ２结果与分析 ２．１卵黄蛋白原的凝胶过滤层析结果 如图１所示，诱导后雄鱼整体匀浆液样品有６ 个洗脱峰；未诱导的雄鱼样品有５个峰。分别取每 个样品的各洗脱峰进行４％～７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电 泳，并进行了糖、脂、磷蛋白检测。诱导后雄鱼样品 的蛋白洗脱组分根据上面方法进行电泳后，结果显 示第２个洗脱峰能够同时被考马斯亮蓝、甲基绿、苏 丹黑、碱性品红４种染色方法同时染色，但蛋白条带 较淡，说明诱导后雄鱼整体匀浆液样品的第２个洗 脱峰可能含有卵黄蛋白原，是要收集的目的蛋白组 分，另外，对比２个样品的层析结果（图１），可以看 出诱导后雄鱼整体匀浆液样品的第二个洗脱峰处， 未诱导的雄鱼样品在此处没有此洗脱峰，从而也可 以确定该峰是要收集的含有Ｖｔｇ的蛋白组分。因此 收集第二个洗脱峰作下一步的实验。 ２．２阴离子交换层析结果 将凝胶过滤层析后收集的Ｖｔｇ蛋白组分上Ｑ ３００ ２ｏｏ ｌ０ｏ ０ 洗脱体积／（ｍＬ） Ｅｌｕｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ） 样品为：诱导后雄鱼整体匀浆液、对照雄鱼整体匀浆液， 柱子为Ｓｅｐｈａｅｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ（ＸＫ １６／７０）（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｂｉｏｔｅｃｈ），洗脱液为：５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（含１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ，ｐＨ ８．０），流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ下洗脱，温度为４℃，蛋白组分每ｍＬ进 行收集．检测器波长２８０ ｎｌｎ 图１剑尾鱼整体匀浆液Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ凝胶 过滤层析结果 Ｎｏｔｅ：Ｓａｍｐｌｅ：ＷＢＨ ｆｒｏｍ ｍａｌｅ ｃｏｎｔｏｒｌ ａｎｄ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ・１７一Ｂ ｔｒｅａｔｅｄ ｍａｌｅ．Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ（ＸＫ １６／７０）．Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０．Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４℃．Ｔｈｅ ｅｌｕａｔｅ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｄｅ ｉｎ １－ｍＬ ｆａｒｃｔｉｏｎｓ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ＵＶ ａｂｓｏｒｂａｎｅｅ ａｔ ２８０ ｎｌｎ ｗａｓ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ． Ｆ．喀．１ Ｇｅｌ ｆｉｈ￣ａｔｉｏｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆＷＢＨ ｆｒｏｍ ｍａｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ ｈｅｌｌｅｒｉ ａｎｄ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ一 １７一ｐ ｔｒｅａｔｅｄ ｍａｌｅ ＾叩ｂｎ ｈｅｌｌｅｒｉ ｏｎ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ ｃｏｌｕｎｍ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ阴离子交换柱层析柱，进行０～１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ梯度洗脱，获得２个洗脱峰Ａ和Ｂ（图 ２）。取各洗脱峰进行４％～７．５％Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ电泳 检测，发现在盐浓度为３６．８％时洗脱下的蛋白峰Ａ 在考马斯亮蓝染色中含有大分子蛋白，相对分子质 量为（５４０±４．３）×１０ （ｎ＝７）。该蛋白同时能被 糖、脂、磷蛋白检测方法检测（图３，见彩插３），且和 诱导后雄鱼整体匀浆液的一条蛋白带处于同一位 置，而这条蛋白带在对照雄鱼的整体匀浆液中是没 有的（图４）。因此可以鉴定峰Ａ蛋白是目的蛋白 Ｖｔｇｏ ３讨论 ３．１剑尾鱼卵黄蛋白原的相对分子质量和结构特 点 卵黄蛋白原（Ｖｔｇ）是所有卵生动物的卵黄蛋白 的前体。Ｖｔｇ相对分子质量在１７０×１０ ～６ＯＯ×１０ 之间，它共价结合有糖和磷，非共价结合有脂类，因 此是一种磷脂糖蛋白。在脊椎动物中，Ｖｔｇ在肝脏 中受雌激素的诱导而合成，然后分泌到血液中随血 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com ２８４ 中国实验动物学报２００７年８月第ｌ５卷第４期 Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉａｔ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｕｇｕｓｔ，２００７．Ｖｏ１．１５．Ｎｏ．４ 白条带染色较则明显。鉴于本文提纯的Ｖｔｇ在 ＰＡＧＥ图谱上只显示５４０×１０ 一条带，说明已经纯化 至较高纯度。 ３．３卵黄蛋白原作为指示鱼类受环境雌激素污染 生物学标记的可能性 本实验结果证明，雌二醇暴露能诱导雄性剑尾 鱼卵黄蛋白原产生，表明鱼体内卵黄蛋白原的诱导 作用可以作为环境风险评价（ＥＲＡ）的有效生物学 标记。本实验以雄性剑尾鱼为实验动物，主要基于 以下几点考虑：首先，剑尾鱼雌雄外形区别明显，实 验取材较方便；其次，雌鱼体内存在卵黄原的清除机 制，而雄鱼体内则不存在该功能，因此若通过雌二醇 诱导，Ｖｔｇ就成为雄鱼血清中的主要蛋白，从而便于 纯化，也便于进行Ｖｔｇ的鉴定；最后，实验动物的取 材可以不受季节的限制。此外，剑尾鱼个体较小，如 何克服鱼体取血难问题，本实验参照Ｈｏｌｂｅｃｈ 为了 解决小鱼体内取血困难而直接从斑马鱼整体匀浆液 中检测Ｖｔｇ的办法进行，也取得较好结果。 （本文图３见彩插３）。 参 考 文 献 Ｇｏｏｄｗｉｎ Ａ Ｅ，Ｇｒｉｚｚｌｅ Ｊ Ｍ，Ｂｒａｄｌｅｙ Ｊ Ｔ，Ｅｓｔｒｉｄｇｅ Ｂ Ｅ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍａｌｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ（１ｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ 【Ｊ Ｊ，１９９２，１０１：４４１—４４６． ［２］ ＨａｌＴｉｅｓ Ｊ Ｅ，Ｓｈｅａｈａｎ Ｄ Ａ。Ｊｏｂｌｉｎｇ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｆｖｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｒｉｖｅｒｓ ｄｅｔｃｅｔｄｅ ｂｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｇｅｄ ｍａｌｅ ｔｒｏｕｔ【Ｊ Ｊ．Ｅｎｖｉｏｒｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９７，１６：５３４—５４２． ［３］ Ｙａｏ ＺＸ．Ｃｒｉｍ ＬＷ．Ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｌｉｎｅ ｆｉｓｈ Ｏｃｅａｎ Ｐｏｕｔ，Ｌｕｍｐｆｉｓｈ ａｎｄ Ａｔｌｎａｔｉｃ Ｃｏｄ． Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９６，１１３Ｂ：２４７—２５３． ［４］ Ｍｅｔｃａｌｆｅ Ｃ Ｄ。Ｍｅｔａｃａｌｆｅ Ｔ Ｌ，Ｋｏｐａｒｉｓｓｉｓ Ｙ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｄｅｔｃｅｔｄｅ ｉｎ ｓｅｗａｇｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌｎａｔ ｅｆｆｌｕｅｎｔｓ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｍｅｄａｋａ（Ｄ ｌａｔｉｐｅｓ）［Ｊ］． Ｅｎｖｉｏｒｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｃｈｅｍ，２００ｌ。２０：２９７—３０８． ［５］ 方展强。张风君，郑文彪，等．多氯联苯对剑尾鱼超氧化物歧 化酶活性的影响［Ｊ］．中国实验动物学报，２００４，１２（２）：９６— ９９． ［６］ 方展强，王春风．硒对汞致剑尾鱼鳃和肝组织总抗氧化能力 变化的拮抗作用［Ｊ］．实验动物与比较医学，２００５，２５（３）：１３６ ｌ３９． ［７］ 方展强，王春风，卫焕荣．硒对汞致剑尾鱼鳃和肝脏组织 Ｎａ＋／Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ活性变化的拮抗性影响［Ｊ］．应用与环境生 物学报，２００６，１２（２）：２２０—２２３． ［８］ Ｓｕｎ ＸＴ，Ｚｈａｎｇ ＳＣ．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉａｚｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｖａｒｙ ｏｆ ａｍｐｈｉｏｘｕｓ（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｂｅｌｃｈｅｄ ｔｓｉｎｇｔａｕｎｅｓｅ）［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ ｐｈｙｓｉｃｏｌ，２００１．１２９Ｂ：１２１—１２７． ［９］ 杨安钢，毛积芳，药立波．生物化学与分子生物学实验技术 ［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００１，４０—４２． ［１Ｏ］ Ｃｏｐｅｌａｎｄ ＰＡ，Ｔｈｏｍａｓ Ｐ．Ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ａ ｍａｒｉｎｅ ｔｅｌｅｏｓｔ，ｔｈｅ ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｅａｔｏｒｕｔ（Ｃｙｎｏｓｃｉｏｎ ｎｅｂｕｌｏｓｕｓ） ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｃａｌ， １９８８．９ｌＢ：ｌ７—２３． Ｕｔｒａａｂｈａｎｄ Ｐ，Ｂｕｎｌｉｐａｔａｎｏｎ Ｐ．Ｐｌａｓｍａ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｏｆ ｇｒｏｕｐｅｒ （Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌ￣ｍａｌａｂａｒｉｃｕｓ）ｉｏｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９６，１１５Ｃ：１０１—１１０． ［１２］ 孙旭彤．文昌鱼的卵黄蛋白原的研究［Ｄ］．博士学位论文，中 国海洋大学，青岛，２００２． ［１３］ 李康．周忠良，于静，等．鲫鱼卵黄蛋白原的ＥＬＩＳＡ检测［Ｊ］． 中国环境科学，２００３，２３（３）：２７６—２８０． ［１４］ 师晓栋．玫瑰无须售巴卵黄蛋白原及卵黄脂磷蛋白的纯化和免 疫学鉴定［Ｄ］．博士学位论文，中国海洋大学，青岛，２００３． ［１５］ 孙亚宁．一种新的文昌鱼的卵黄蛋白原的鉴定和研究［Ｄ］． 硕士学位论文，中国海洋大学，青岛，２００４． ［１６］ Ｂａｎａｓｚａｋ Ｌ，Ｓｈａｒｒｏｅｋ Ｗ，Ｔｉｍｍｍｌｎ Ｐ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｏｐｐｒｏｔｅｉｎ：ｌｉｏｐｖｉｔｅｌｌｉｎｌ Ｊ Ｊ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ，１９９１．２０： ２２ｌ一２４６． ［１７］ Ｈｉｒａｍａｔｓｕ Ｎ，Ｈａｒａ Ａ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｒｌａｔｄｅ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓａｋｈａｌｉｎ Ｔａｉｍｅｎ（Ｈｕｃｈｏ Ｐｅｒｒｙｉｌ）［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ。１９９６，ＩＩ５Ａ：２４３—２５１． ［１８］ Ｓｈｉｉｍｚｕ Ｍ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｙ，Ｆｕｋａｄａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｆｒｏｍ ａｓｃｉｔｅｓ ｏｆ Ｍｅｄａｋａ （Ｏｒｙｚ／ａｓ Ｌａｔｉｐｅｓ）ｔｅｒａｔｄｅ ｗｉｔｈ ｅｓｔｒｏｇｅｎ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｚｏｏｌ，２００２，２９３： ７２６—７３５． ［１９］ 胡东，桂建芳．银鲫卵黄原的诱导、分离纯化及其生化鉴定 ［Ｊ］．水生生物学报，２００２，２６（２）：１０９—１１４． ［２Ｏ］ Ｈｏｌｂｅｃｈ Ｈ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｌ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｇ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｍ ｒｅｒｉｏ）ｌＪ Ｊ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｃｏｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１３０Ｃ：１１９—１３１． ［收稿日期］２００６．１２．１８ 维普资讯 http://www.cqvip.com
