(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105821024 A(43)申请公布日 2016.08.03
(21)申请号 201610379619.7(22)申请日 2016.05.30
(71)申请人 成都蓉生药业有限责任公司
地址 610041 四川省成都市高新区起步园
科园南路7号(72)发明人 余伟 鲁涛 牟蕾 李伟 王黔川 (74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务
所(普通合伙) 51222
代理人 李高峡 张娟(51)Int.Cl.
C12N 9/64(2006.01)C07K 14/75(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页 附图1页
(54)发明名称
一种制备人凝血酶原复合物的方法(57)摘要
本发明公开了一种人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化；(4)配制，除菌，分装，冻干，干热处理，即可。本发明方法FIX回收率高达约58-67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。
CN 105821024 ACN 105821024 A
权 利 要 求 书
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1.一种人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.4～1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；
(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化
将制品温度和pH分别调节至10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.2～1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；
即可。(4)配制，除菌，分装，冻干，干热处理，
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(3)中，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液均是含有NaCl和枸橼酸钠的溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：平衡缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.08mol/L、0.01mol/L；洗涤缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.17～0.23mol/L、0.01mol/L；洗脱缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为2.0mol/L、0.015mol/L。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，吸附的时间为45～60min。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，透析采用的透析液是温度为15～25℃、pH为7.0～7.4的浓度为0.015mol/L的枸橼酸钠溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述S/D病毒灭活的方法是：取步骤(1)制得的制品，加入肝素钠，再加入Tween-80和TNBP使Tween-80和TNBP的最终浓度分别为1％(w/v)和0.3％(v/v)，待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：肝素钠的加入量为1～3IU/ml制品。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，吸附的时间为30～60min。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，透析采用的透析液是含0.1mol/L NaCl、0.015mol/L枸橼酸钠、20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸的溶液，其温度为15～25℃、pH为6.9～7.1。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，配置时加入肝素钠，肝素钠加入量是制品中FIX含量的0.1～0.3倍。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，干热处理的条件是80℃干热处理72小时。
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CN 105821024 A
说 明 书
一种制备人凝血酶原复合物的方法
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技术领域
[0001]本发明属于血液制品领域，具体涉及一种制备人凝血酶原复合物的方法。背景技术
[0002]人凝血酶原复合物，主要用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症(单独或联合缺乏)包括：1.凝血因子Ⅸ缺乏症(乙型血友病)，以及Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ凝血因子缺乏症；2.抗凝剂过量、维生素K缺乏症；3.肝病导致的出血患者需要纠正凝血功能障碍时；4.各种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者，但对凝血因子V缺乏者可能无效；5.
6.逆转香豆素类抗凝剂诱导的出治疗已产生因子Ⅷ抑制物的甲型血友病患者的出血症状；
血。
[0003]人凝血酶原复合物是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的反应条件和保护剂的使用对工艺中FIX收率有显著性影响，但是目前制备人凝血酶原复合物的方法存在FIX回收率低，对血浆中其他有效成分影响大的问题。[0004]如，魏舒等，“冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究”，中国输血杂志，2008,21(4):282～284公开了一种人凝血酶原复合物生产工艺，制品经过S/D病毒灭活时未采取合适的保护剂，凝血因子II、VII、IX和X活性回收率分别损失20％左右。
[0005]公告号102151289B的专利申请公开了一种制备人凝血酶原复合物的方法，其FIX回收率仅为45～49万IU/吨血浆，且未采取降低人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附的步骤，导致宝贵的血浆资源浪费。
[0006]公开号为104109202A的专利申请也公开了一种制备人凝血酶原复合物的方法，其FIX回收率较高，但是其工艺中多步澄清过滤增加操作难度和生产成本，并且按照柱床体积与上样的血浆量的比例为1：10～1:50来计算，要实现1吨血浆/批的处理，使用凝胶量为20～100L，按Capto DEAE市场价格计算，凝胶成本为300～1500万元，远远高于每吨血浆实现人凝血酶原复合物价值，因此，成本太高，实际应用价值不大。[0007]因此，需要提供一种成本低廉的、FIX回收率高的方法。发明内容
[0008]本发明提供了一种人凝血酶原复合物的制备方法。[0009]去冷沉淀上清血浆：即去冷沉淀血浆。[0010]本发明人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：[0011](1)预纯化
[0012]取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.4～1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；[0013](2)S/D病毒灭活；[0014](3)精制纯化
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CN 105821024 A[0015]
说 明 书
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将制品温度和pH分别调节至10～15℃和7.0～7.4，按照每1L上清血浆使用1.2～
1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；[0016](4)干热处理，即可。[0017]步骤(1)和步骤(3)中，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液均是含有NaCl和枸橼酸钠的溶液。[0018]优选地，
[0019]平衡缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.08mol/L、0.01mol/L；[0020]洗涤缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.17～0.23mol/L、0.01mol/L；[0021]洗脱缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为2.0mol/L、0.015mol/L。[0022]步骤(1)中，吸附的时间为45～60min。[0023]步骤(1)中，透析采用的透析液是温度为15～25℃、pH为7.0～7.4的浓度为0.015mol/L的枸橼酸钠溶液。[0024]步骤(2)中，所述S/D病毒灭活的方法是：取步骤(1)制得的制品，加入肝素钠，再加入Tween-80和TNBP使Tween-80和TNBP的最终浓度分别为1％(w/v)和0.3％(v/v)，待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时。其中，肝素钠的加入量为1～3IU/ml制品。
[0025]步骤(3)中，吸附的时间为30～60min。[0026]步骤(3)中，透析采用的透析液是含0.1mol/L NaCl、0.015mol/L枸橼酸钠、20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸的溶液，其温度为15～25℃、pH为6.9～7.1。[0027]步骤(4)中，肝素钠加入量是制品中FIX含量的0.1～0.3倍。配置时加入肝素钠，[0028]步骤(4)中，干热处理的条件是80℃干热处理72小时。[0029]本发明方法FIX回收率高达约58-67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。[0030]显然，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离根据本发明的上述内容，本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0031]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0032]图1为人凝血酶原复合物的制备流程图。
具体实施方式
[0033]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒说明书选择。
[0034]实验试剂：枸橼酸钠，氯化钠，甘氨酸，盐酸赖氨酸，DEAE Sephadex A50凝胶均为市售品。
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CN 105821024 A[0035]
说 明 书
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实施例1 本发明人凝血酶原复合物的制备方法
[0036]一、制备方法[0037](1)预纯化
[0038]将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至10℃，用醋酸缓冲液将pH调整到7.0。按1.4g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀后的凝胶，吸附时间为45min。收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，完成后计量制品的体积。[0039](2)S/D病毒灭活
[0040]按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。[0041](3)精制纯化
[0042]将制品温度和pH分别调整到10℃和7.0，按1.2g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀后的凝胶，吸附时间为30min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。[0043](4)干热处理
[0044]冻干后的制品经80℃、以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完72小时干热处理，成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。[0045]其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0；
[0046]洗涤液含0.17mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0；[0047]洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0；[0048]首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.0；[0049]二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖
pH值为6.9；氨酸，温度值为15℃，
[0050]S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。[0051]二、检测[0052]1、检测方法
[0053](1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2015年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
[0054](2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法：按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。[0055]2、检测结果[0056](1)FIX回收率[0057]经检测，本发明工艺的FIX回收率为58万(FIX IU/吨血浆)。[0058](2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率[0059]结果如下表：
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CN 105821024 A[0060]
说 明 书
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产品名称白蛋白免疫球蛋白吸附后血浆95％94％回洗液5％4％总收率100％98％[0061]可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收率高达100％和98％。
[0062]实施例2 本发明人凝血酶原复合物的制备方法[0063]一、制备方法[0064]⑴预纯化
[0065]将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至13℃，用醋酸缓冲液将pH调整到7.2。按1.5g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为50min。收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，完成后计量制品的体积。[0066]⑵S/D病毒灭活
[0067]按2IU/ml制品比例加入肝素钠后，再加入S/D储备液使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。[0068]⑶精制纯化
[0069]将制品温度和pH分别调整到13℃和7.2，按1.3g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为45min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.2IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。[0070]⑷干热处理
[0071]冻干后的制品经80℃、以灭活可能残留的污染病毒。72小时干热处理，
[0072]干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。[0073]其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为13℃，pH值为7.2；
[0074]洗涤液含0.20mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为13℃，pH值为7.2；[0075]洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为13℃，pH值为7.2；[0076]首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为20℃，pH值为7.2；[0077]二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸，温度值为20℃，pH值为7.0；
[0078]S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。[0079]二、检测[0080]1、检测方法
[0081](1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2015年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
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CN 105821024 A[0082]
说 明 书
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(2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法：按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分
析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。[0083]2、检测结果[0084](1)FIX回收率[0085]经检测，本发明工艺的FIX回收率为67万(FIX IU/吨血浆)。[0086](2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率[0087]结果如下表：
[0088]
产品名称白蛋白免疫球蛋白吸附后血浆94％98％回洗液7％4％总收率101％102％[0089]可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收率高达101％和102％。
[0090]实施例3 本发明人凝血酶原复合物的制备方法[0091]一、制备方法[0092]⑴预纯化
[0093]将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至15℃，用醋酸缓冲液将pH调整到7.4。按1.6g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为60min。收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，完成后计量制品的体积。[0094]⑵S/D病毒灭活
[0095]按3IU/ml制品比例加入肝素钠后，再加入S/D储备液使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。[0096]⑶精制纯化
[0097]将制品温度和pH分别调整到15℃和7.4，按1.5g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为60min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.3IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。[0098]⑷干热处理
[0099]冻干后的制品经80℃、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。[0100]干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。[0101]其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4；
[0102]洗涤液含0.23mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4；[0103]洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4；[0104]首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为25℃，pH值为7.4；
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CN 105821024 A[0105]
说 明 书
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二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖
氨酸，温度值为25℃，pH值为7.1；
[0106]S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。[0107]二、检测[0108]1、检测方法
[0109](1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2015年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
[0110](2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法：按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。[0111]2、检测结果[0112](1)FIX回收率[0113]经检测，本发明工艺的FIX回收率为63万(FIX IU/吨血浆)。[0114](2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率[0115]结果如下表：
[0116]
产品名称白蛋白免疫球蛋白吸附后血浆93％98％回洗液10％5％
103％总收率103％
[0117]可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收率高达103％和103％。
[0118]将本发明方法制备得到的产品进行质量检测，检测结果如下：[0119]表1 成品检定结果
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CN 105821024 A[0120]
说 明 书
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[0121]
实验结果说明，本发明方法制备的人凝血酶原复合物凝血因子含量均衡，安全、有本发明所建立的人凝血酶原复合物制备方法，反应条件温和，对S/D处理、冻干及
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效。
[0122]
CN 105821024 A
说 明 书
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干热处理过程中合理使用保护剂，有效的实现了凝血因子的分离纯化，降低了凝血因子激活的风险；并且工艺稳定性高，批件差异小，凝血因子含量均衡，能很好的发挥临床使用效果；再者采用S/D病毒灭活和80℃、72小时干热处理的两步病毒灭活方法，制品病毒安全性得到极大提高。本发明能稳定且可靠的制备出安全、有效的制品。[0123]为了进一步说明本发明的有益效果，下面从技术提高带来的商业价值来阐述：[0124]现有技术中，采用吸附法制备人凝血酶原复合物的方法，FIX回收率仅为45～49万IU/吨血浆，而本发明吸附法的回收率高达58～67万IU/吨血浆，也就是说，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，每吨血浆比现有方法可以多收9～22万IU/吨血浆。[0125]按照每年投浆600吨来计算，采用本发明方法，可多回收5400～12000万IU FIX,以市场价格约0.8元/IU计算，可增加4320～15000万元收入。[0126]综上，本发明方法FIX回收率高，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且未采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。
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说 明 书 附 图
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