第３０卷第８期２０１１年８月 种子（ｓｅｅｄ） Ｖｏ１．３０ Ｎｏ．８ Ａｕｇ．２０１１ 分子标记在青稞中的应用现状及前景 张玉清 （青海省农林科学院， 西宁８１００１６） Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｕｓ ＱＵＯ ａｎｄ Ｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｂａｒｅ Ｂａｒｌｅｙ ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｑｉｎｇ 摘要：分子标记反映了ＤＮＡ分子的多态性，可以作为研究生物 国栽培最早的大麦 』。青稞分为白青稞，黑青稞，墨 遗传变异和进化关系的重要手段。本文介绍了常用分子标记 技术的原理、方法、特点及其在青稞上的应用现状，同时展望了 分子标记技术在青稞上的应用前景。 绿色青稞等种类。青稞在青藏高原具有悠久的栽培历 史，距今已有３ ５００年。青稞主要分布在我国、青 海、四川的甘孜州和阿坝州、云南的迪庆、甘肃的甘南 等地海拔４ ２００—４ ５００ ｍ的青藏高寒地区。青稞是藏 关键词：青稞；分子标记；ＳＳＲ；ＲＡＰＤ；ＳＲＡＰ 中图分类号：Ｓ５１２．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００ｌ一４７０５（２０１１）０８－００８６－０３ 族人民制作“糌粑”的主要食粮，也是主饮“青稞酒”的 原料，还可以用于生产啤酒和保健食品等 Ｊ。近年 来，青稞的育种与利用备受大麦育种者的青睐。开展 大麦是世界上最古老的栽培作物之一，也是遗传 学、分子生物学研究的模式植物之一。青稞（Ｈｏｒｄｅｕｍ ａｒｅ Ｌ．ｖａｒ．ｎｕｄｕｍ Ｈｏｏｋ．Ｆ）也叫裸大麦、元麦、米 麦，是我国藏族人民对裸大麦的爱称。六棱裸大麦 （Ｈ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｓｐ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ ｖａｒ．ｎｕｄｕｍ Ｈｓｔｉ）是在我 收稿日期：２０１１—０４—０３ 基金项目：国家大麦产业技术体系。 青稞种质资源的遗传多样性研究，对于保护青稞资 源，选育青稞新品种，提高藏区人民的生活水平，维护 藏区稳定，大有裨益。分子标记技术直接以ＤＮＡ的形 式表现，不受组织特异性、发育阶段、环境等影响；且数 量多，几乎遍及整个基因组；多态性高在植物育种等领 域得到广泛应用ｒ 。本文综述了青稞中常用分子标记 的现状及前景，以期对青稞的分子标记育种有所帮助。 作者简介：张玉清（１９７８一），男，青海互助人；主要从事作物育种工作； Ｅ・ｍａｉｌ：ｑｈｚｙｑｉｎｇ＠１６３．ｃｏｒｎ。 （接上接） 指数、小区产量、单瓜重、中心糖表现超过中亲值；分别 有６５．９１％、２９．５４％、４３．１８％、３１．８２％、３４．０９％、 西瓜杂种一代坐果指数的表现倾向于高亲亲本， 坐果指数介于中亲一高亲之间的组合１５个，占 ３４．０９％；高于高亲的组合有１９个，占４３．１８％，其中 差异达到显著水平的组合为３个，占６．８２％。 西瓜杂种一代的小区产量、单瓜重的表现倾向于 高亲亲本，介于中亲一高亲之间的组合１６个，占 ４０．０９％的组合在开花期、果实发育期，坐果指数、小区 产量、单瓜重、中心糖上表现出超亲优势，超亲优势达 到显著水平的比例在４．４５％～１１．３６％之间。４４个杂 交组合的６个性状总体表现倾向于早熟或高亲亲本。 目前，西瓜杂种优势研究不多，而且多数农艺性状 都容易受到环境条件的影响，以上结论毕竟是在单点 ３６．６７％；小区产量高于高产亲本的组合为１４个，占 ３１．８２％，其中差异达到显著水平的组合为５个，占 １１．３６％；单瓜重高于高亲的组合为１５个，占３４．０９％， 其中差异达到显著水平的组合为４个，占９．０９％，小 区产量与单瓜重在超亲优势上基本一致。 西瓜杂种一代的中心糖表现倾向于高糖亲本，介 于中亲一高亲之间组合为１５个，占３４．９１％，中心糖 超过高糖亲本的组合为１８个，占４０．０９％，其中差异达 到显著水平组合仅为２个，占４．５５％。 有限的材料之间进行，如果要更好地运用于西瓜育种 实践，一方面需要开展更广泛的试验，另一方面应开展 西瓜亲本的差异与杂种优势的相关性方面的研究。 参献文献： ［１］林德佩．西瓜的生态型和杂种优势利用［Ｊ］．中国果树，１９８０ （２）：６０—６４． ［２］杨健．国外西瓜种质资源在我国的利用［Ｊ］．作物种质资源， １９９５（４）：４３—４４． ３结论与讨论 综上所述，西瓜４４个组合中有７０％以上的组合 ［３］刘东顺．西瓜杂优利用的配合力分析［Ｊ］．西北农业学报， １９９４，３（３）：５７—６１． ［４］卢庆善，孙毅，华泽田主编．农作物杂种优势［Ｍ］．北京：中 国农业科技出版社，２０００：１—９０． 开花期、果实发育期早于中亲值；约７０％的组合坐果 ・８６・ 问题探讨 张玉清：分子标记在青稞中的应用现状及前景 １育种中常用的分子标记种类 １．１基于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的分子标记 态位点的多态信息指数为０．１６—０．９１，平均为０．６５。根 据ＰＩＣ值选择了１３个ＳＳＲ标记用于我国青藏高原栽培 青稞基因型鉴定，这些标记的ＰＩＣ值为０．６以上。 杨平等 利用ＳＲＡＰ分子标记技术，对２５份来自 性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎ ｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）、小卫星ＤＮＡ或可变数目串连重 复序列（ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ，ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅ— ｐｅａｔｓ或ＶＮＴＲｓ）。原位杂交。 １．２以ＰＣＲ（聚合酶链式反应）为基础的分子标记 四川高原的青稞育成品种进行了遗传多样性研究。从 ６４对引物组合检测出９９９条清晰条带，６２对可以 获得多态性条带，多态性引物组合占９６．９％，生 ２２５条多态性条带，占总条带数的２２．５％。６４对引物 ２Ｏ世纪８Ｏ年代，ＤＮＡ聚合酶链式反应即ＰＣＲ技 术的出现，推动了第二代分子标记技术的产生和发展。 组合共扩增出３３３种等位变异，平均每个引物组合检 此项技术是模仿ＤＮＡ在生物体内的自然复制过程来 扩增ＤＮＡ片段。ＰＣＲ的模板是ＤＮＡ，依据被扩增区 域两侧边界ＤＮＡ序列人工合成引物（通常为２０个碱 基的单链脱氧核苷酸小片段），每种引物分别与对应 的一条ＤＮＡ链互补，在ＤＮＡ聚合酶的作用下扩增 ＤＮＡ片段。ＰＣＲ反应一般分３步完成一个循环：１．高 温变性，使ＤＮＡ双链解开；２．低温退火，让引物与单链 模板互补结合；３．中温延伸，以互补的引物为复制起 点，ｄＮＴＰｓ为原料，进行复制。这样一次循环，ＤＮＡ就 扩增１倍。经２５—３０次循环后，ＤＮＡ的量就达到足 以检测的水平（ｎｇ级）。ＰＣＲ的优点是不需要同位 素，安全性好，便宜，快速易行，易于自动化。目前大多 数分子标记技术都是建立在ＰＣＲ技术的基础之上的。 随机扩增多态性ＤＮＡ（ｍｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐ０ｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）、微卫星标记育种（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ）或 简单序列重（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲｓ）、ＳＣＡＲ（Ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ—ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）、扩增片段长度 多态性（Ａｍｐｌｉｉｆｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎ￣ｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＡＦＬＰ）。相关序列扩增多态性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｍ— ｐｌｉｉｆｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）。 ２分子标记在青稞中的应用 ２．１遗传多样性的研究 现代育种对种质资源的遗传多样性及其亲缘关系 信息很重要，是育种工作的基础。因此，研究人员对青 稞的遗传多样性进行了大量的研究。 潘志芬等 采用ＳＳＲ标记分析了６４份青藏高原 栽培青稞的遗传多样性，同时评估ＳＳＲ标记在我国大 麦育种和品种鉴定中的应用潜力。选择了３０个已知 作图位点ＳＳＲ标记，其中２５个标记与重要性状的控 制位点连锁紧密。选择的３０个ＳＳＲ标记，５个未得到 很好的扩增产物，３个无多态性。２２个多态性ＳＳＲ标记 位点中，每位点检测出等位基因２一ｌ５个，共检测出等 位基因１３２个，平均每位点６．０个。各多态位点检测出 基因型为２—１１种，位点ＨＶＭ ３３的基因型最多。各多 测到５．２０种等位变异。遗传多样性在０（ｍｅ９／ｅｍ １４， ｍｅ ９／ｅｍ １５）～０．８９２ ８（ｍｅ ６／ｅｍ １８）之间，平均为 ０．５１２ ６。聚类分析结果表明，２５份材料可分成Ａ、Ｂ、 ｃ三大类，材料聚类与其来源地有明显的相关性。２５ 份材料间的平均遗传距离较小（０．３２４ ０），平均遗传多 样性较低（０．５１２ ６），遗传基础较为狭窄。 洪棋斌 。。等利用ＲＡＰＤ分子标记，对四川西北部 青裸４２个农家品种及２个育成品种的遗传背景进行 了研究。用筛选出的１７个１０碱基随机引物，共扩增 出７９条多态性谱带，结果表明，取距离值Ｔ＝０．６，可 将４４个品种分为四大类。通过分析发现大部分品种 在各类中表现出一定规律性分布。通过不同多态性位 点数的遗传距离的标准差和变异系数变化趋势的分 析，表明所得到的位点数已能可靠地对研究样本的遗 传关系进行估计。 盂凡磊等 １ｌ， 利用基于内含子切接点引物和长随 机引物的ＰＣＲ分子标记技术，对主要农区青稞品 种进行了遗传多样性分析。选用的５条引物共扩增出 稳定清晰的条带３９条，其中２６条（６６．７％）为多态性条 带，参试材料表现出了丰富的差异。根据实验结果，应 用相关软件进行分析，并结合这些品种的主要表型性状 进行分析，结果表明，主要农区青稞品种间有一定 的遗传差异，但总体遗传差异较小，遗传基础相对狭窄； 聚类结果与各品种的实际生产利用情况较为接近，可以 反映出这些青稞品种较为明显的区域特征。表明利用 分子标记技术可以很好地揭示品种间的遗传进化关系。 在ＤＮＡ水平上可以将青稞品种分成四大类。 ２．２构建青稞指纹图谱 潘志芬等 结合ＰＩＣ值和基因型差异，选择了８ 个多态信息含量高的ＳＳＲ标记，构建了高效指纹图 谱，此图谱能把６４份材料完全区分。 曾宇等 利用ＲＡＰＤ技术对高原青稞２１个 育成品种和２个农家品种进行了遗传多样性分析，并 用引物Ｓ３２和ｓ １８扩增的１９条多态性带建立了品种 的分子指纹图谱。 ・８７・ 第３０卷第８期２０１１年８月 种子（Ｓｅｅｄ） Ｖｏ１．３０ Ｎｏ．８ Ａｕｇ．２０１１ ２．３ 一葡聚糖的研究 我国不同地区大麦品种（系）的 －葡聚糖含量分 布及品种环境效应不同。从地区分布看，３／－葡聚糖高 于８％的基因型出现在的样本，裸大麦的 一葡聚 糖高于皮大麦。同一品种在不同的年度地区含量也有 差异，主要是籽粒灌浆结实的条件不同造成的。Ｆａｓｔ． ｎａｕｇｈｔ等认为，籽粒成熟期间低温、凉爽的气候有利于 口－葡聚糖含量的积累。 曾宇等ｕ 依据ＧｅｎＢａｎｋ中 一１，３一葡聚糖酶基 因的保守序列设计简并引物，通过反转录聚合酶链式 反应和快速分离ｃＤＮＡ末端技术扩增得到青稞』Ｂ－１，３一 葡聚糖酶Ⅱ（ＨＢＧＨ ２）基因全长ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ注册 号ＡＦ５１５７８５）。该ｃＤＮＡ全长由１ ２１５个碱基组成， 包含一个完整的编码３３４个氨基酸的开放阅读框 （ＯＲＦ），构成一个３５ ｋＤａ的前体蛋白，成熟蛋白由３０６ 个氨基酸组成，前２８个氨基酸为信号肽，在起始密码 子上游有一个由４６个碱基组成的５ Ｅ编码区；在终止 密码子下游有一个由１６５个碱基组成的３ 非编码区， 包括１个加ｐｏｌｙ（Ａ）信号和一个长度为１９个腺苷酸 的ｐｏｌｙ（Ａ）尾。经Ｂｌａｓｔ发现，推测的多肽序列与已发 表的大麦 －１，３－葡聚糖酶Ⅱ基因具有９９％的同源性， 根据得到的 一１，３－葡聚糖酶Ⅱ基因的ｃＤＮＡ序列设计 引物，采用基因组步查技术克隆了青稞基因组中的一 个２ １３５ ｂｐＤＮＡ片段（ＧｅｎＢａｎｋ注册号ＡＹ １７８８３８）。 序列分析结果表明，该基因也包含了同上的开放阅读 框，在５ ，除具有４６个核苷酸外，还包含一个７７３核苷 酸的５ 上游序列，含有推测的２个ＴＡＴＡ盒，４个 ＣＡＡＴ盒和４个ＧＣ盒，该基因的编码区内具有大麦 口．１，３．葡聚糖酶Ⅱ基因的基因特征：信号肽与成熟蛋 白之间的内含子，长１６５ ｂｐ。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示多条 带，ＲＴ．ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交只在发芽６ ｄ和９ ｄ的苗 中检测到信号。由此认为该青稞 ．１，３．葡聚糖酶Ⅱ 基因在结构上与大麦』Ｂ一１，３－葡聚糖酶Ⅱ基因是同源 的，是口一１，３ 葡聚糖酶基因家族中的一个新成员。该 基因的克隆，为深入研究 一１，３一葡聚糖酶Ⅱ基因结 构，表达和调节机制及其结构和功能的关系奠定了重 要的基础。 ３展望 利用分子标记，可以在ＤＮＡ分子水平上科学地选 配育种亲本、利用与重要目标性状连锁的分子标记则 可以对杂交后代进行科学的选择，而且不受环境条件 和作物生育期的影响，鉴定结果稳定可靠，具有选择效 率高、准确性高、成本低等优点，可大大缩短育种时间。 分子标记技术在青稞上的应用，可以研究青稞种质资 ・８８・ 源的ＤＮＡ分子多态性，筛选出适合青稞种质资源指纹 图谱鉴定的分子标记技术，找出不同青稞种质资源间 的分子标记，直接为青稞品种改良和种质资源的鉴定、 保存提供可靠的遗传标记和新技术新方法，为下一步 研究各种遗传标记的遗传连锁关系、分子标记辅助育 种、遗传图谱构建、数量基因座定位及基因克隆打基 础，对青稞染色体组结构和功能基因组研究等方面也 有重要意义。希望分子标记技术能为我国青稞育种发 挥更大的作用。 参考文献： ［１］卢良恕．中国大麦学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９６：８８ 一ｌｌ３． ［２］巴桑玉珍，强小林．青稞育种的成就与经验分析［Ｊ］．西 藏农业科技，２００４，２７（１）：２６—３６． ［３］潘志芬．青藏高原栽培青稞遗传多样性研究［Ｄ］．中国科学 院研究生院，成都生物研究所，２００６． ［４］尼玛扎西．青稞与高原地区的食物保障优势与作用［Ｊ］．西 藏农业科技，１９９８，２０：２０—２５． ［５］栾运芳，何燕．青稞品质改良的趋势和对策［Ｊ］．大麦科 学，２００４（１２）：１—４． ［６］刘梅金，闫春梅．浅议甘南州青稞生产的意义及产品开发的 探索［Ｊ］．甘肃科技，２００６，２２（５）：２０２—２０３． ［７］贾继增．分子标记种质资源鉴定和分子标记育种［Ｊ］．中国 农业科学，１９９６，２９（４）：１—１０． 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