www.zgzysy.com2016年第8期兽医实验室ELISA试验中常出现的问题及解决方法吴召坤 巩雪英 刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。无溶血，样品溶血后血清样品中的血红蛋白可造成假阳性。2.样品被细菌污染，菌体中的某些物质会产生假阳性反应。3.僻免样品反复冻融。4.样品不清亮，样品里有可见的纤维蛋白絮状物，易造成假阳性。因而分离血清时应待血液完全凝固，血清自然析出，在分离出合格血清。（二）加样1.样品的稀释要按照试剂说明书上规定的稀释倍数稀释血清，避免血清中的非特异性IgG过多，这些非特异性IgG与酶标二抗反应极易出现假阳性2.如果加入的酶结合物过多或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。（三）温育在做ELISA试验时，一定要按照温育的时间和温度进行，温育的时间和温度的改变都会对反应有影响，因而：1.温育时间过短，温度过低，易致显色不全。温育时间过长，温度过高，易致非特异结合物紧附于反应孔周围，难以清洗彻底，产生阴性高值或假阳性反应，因而在温育时要严格按照规定的温度和时间进行温育。二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。温育时间不足，温度过低都会影响显色。4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。三、假阳性和假阴性（一）样品的采集和保存1.样品应清亮、透明、新鲜、69Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.兽医实验室2016年第8期www.zgzysy.com德惠地区鸡新城疫血清学调查窦海艳 李建华 李鑫 张春媛 丁国杰/哈药集团生物疫苗有限公司ND在部分地区流行依然严重，且表现出新的流行病学特点，如高免鸡群发病等。为了解德惠地区鸡场新城疫免疫抗体的水平，更好地预防和控制其发生和流行，本研究于2015年对该地区7个养鸡场新城免疫抗体抽样检测，现将检测结果报道如下。一、材料与方法（一）材料1.被检血清。2015年4月份至鸡新城疫（NewCastledisease）又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由副黏病毒科的新城疫病毒引起的急性高度接触性传染病，传播迅速，对鸡养殖业造成严重危害和巨大的经济损失。对该病的防治目前没有特别有效的手段，主要通过接种疫苗来进行预防。最近的研究表明，新城疫的流行表现出一些新的趋势，即在目前普遍采用疫苗免疫的情况下，2015年5月份，选择德惠部分地区7个养鸡场，分别用A、B、C、D、E、F和G表示，每个鸡场的采样比例为5‰左右，每个样品采血量2ml用于制备待检血清。抽样禽场均已按2.将反应板放入恒温箱时，反应板不能叠放，以保证反应板受热均匀，温度能迅速达到平衡。3.不同厂家，不同批次试剂的洗涤液不能混用。4.配制洗涤液用水的质量很重要，关系试验成败，准确与否，洗涤用水最好用新鲜合格的蒸馏水。平稳，保证仪器运转正常。2.按照试剂说明书要求调整好酶标仪的检测波长。3.显色结束加终止液后，应尽快测定OD值，一般在10min内测定。4.酶标仪不用时应放置在干燥、干净的仪器室，加盖防尘罩，同时应定期对酶标仪进行效验，确保仪器运转正常，精确。四、洗板1.要按照试剂说明书上的说明配制好洗涤液，配制洗涤液用水最好为新鲜的蒸馏水，配制倍数准确。2.洗板时要按照试剂说明书上的洗涤方法洗涤，不能随意改变洗涤方法，洗涤时间，洗涤次数。五、OD值测定显色完成，加终止液后将反应板放入酶标仪检测OD值。1.在反应结束前应将酶标仪开启，预热10～20min，仪器放置应70Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.
