BP神经网络结合正交试验法优化Bacillus velezen,sis 2-27菌株培养基组分

Bacillus velezen,sis 2-27菌株培养基组分

作者：甄新武，乔均俭(

来源：《湖北农业科学》 2013年第13期

甄新武，乔均俭

（河北农业大学理学院，河北 保定 ０７１００１）

摘要：将ＢＰ人工神经网络（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｉ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）技术与传统的正交试验方法相结合，提出一种新的试验分析和处理方法，利用神经网络特有的自学能力，对主要影响因素进行仿真优化，获得Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７菌株培养基组分，即玉米粉２．０％、豆饼粉１．５％、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０７％，起始ｐＨ为７．０、接种量为２．０％，应用优化得到的培养基组分进行验证试验，取得了较好的效果。

关键词：ＢＰ人工神经网络（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｉ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）；正交试验；培养基；Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７菌株

中图分类号：Ｑ９３６

文献标识码：Ａ

文章编号：0439－８114（２０13）13－3109-03

Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎ—Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＢＰ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｉ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｗｉｔｈ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

ＺＨＥＮ Ｘｉｎ－ｗｕ，ＱＩＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ， ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｅｓｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄａｔａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｈｉｃｈ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＢＰ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｌｐ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｂ. vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ２.0％， ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ

１．５％， ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０７％ ａｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．０， ｗｉｔｈ

ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ２.0％． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｖｅｒｉｆｉｅｄ， ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＢＰ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ； ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７ ｓｔｒａｉｎ

近年来，健康和生态环境问题日益受到重视，中国已全面启动实施无毒、无公害的微生态饲料添加剂工程。农业部于１９９４年公布的可用于微生态制剂生产的菌种包括乳酸杆菌、芽孢杆菌、粪链球菌、酵母菌和双歧杆菌。其中芽孢杆菌可以使肠道内形成有利于厌氧微生物生长的环境，从而保持肠道微生态系统平衡。芽孢杆菌在肠道中还可以产生多种消化酶和有机酸，这有益于提高饲料的利用率，抑制有害菌的繁殖，可为乳酸杆菌等菌群的生长创造有利条件。所以，芽孢杆菌是一种理想的动物微生态制剂的生产菌种。Ｚ－２７菌株［１］是以来自猪粪便的耐高浓度胆酸盐的产芽孢菌株为出发菌株，以大肠杆菌为病原指示菌，经过初筛、复筛筛选出的具有较高拮抗活性的芽孢杆菌，对其进行了菌种鉴定，经鉴定为Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ。

人工神经网络（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｉ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ），简称神经网络，是近几年迅速发展起来的一门集神经科学、信息科学、计算机科学于一体的交叉边缘学科，是生物神经网络 （Ｂｉｏｌｏｇｙ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）在结构、功能及某些基本特性方面的理论抽象和模拟而构成的一种信息处理系统［２，３］。本研究以Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７为发酵菌株，利用ＢＰ神经网络结合正交试验法优化其培养基发酵条件，旨在降低生产成本，为进一步研制具有抗腹泻功能的猪用益生菌制剂奠定基础。

１ 材料与方法

１．１ 材料

Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７菌株，由河北农业大学生命科学学院实验室保存。

１．２ 培养基

ＮＡ培养基、ＮＢ培养基、ＬＢ培养基。

摇瓶发酵基础培养基：蛋白胨１．０％，葡萄糖１．０％，ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ ０．２％，Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ ０．４％，ＣａＣｌ２ ０．０２％，蒸馏水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。

１．３ 试验方法

１．３．１ 单因素试验确定培养基组分 根据试验需要单因素改变基础培养基的碳源、氮源、无机盐。摇床转速１７０ ｒ／ｍｉｎ，摇瓶装液量５０ ｍＬ，接种１０～１２ ｈ芽孢杆菌Ｚ－２７菌株种子液，接种量２．０％，３７ ℃培养２４ ｈ。考察单因素对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株发酵液活菌浓度、发酵液抗菌活性及芽孢产率的影响，从而得到最佳碳源、氮源和无机盐。

利用发酵液梯度稀释后涂布平板的活菌计数法测定芽孢杆菌Ｚ－２７菌株摇瓶发酵液活菌浓度。芽孢观察和计数采用孔雀绿芽孢染色和血球计数板直接计数相结合的方法，将培养液稀释一定倍数后在显微镜下观察，计算芽孢产率。采用琼脂打孔扩散法测定发酵液抗菌活性。

１．３．２ 正交试验优化培养条件 培养基组成及接种量等培养条件对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株发酵的影响按正交试验表Ｌ１６（４５）进行考察［４－８］。碳源采用１．０％、

２．０％、３．０％、４．０％四个水平；氮源采用０．５％、１．０％、１．５％、２．０％四个水平；无机盐采用０．０１％、０．０３％、０．０５％、０．０７％四个水平；ｐＨ采用６．５、７．０、７．５、８．０四个水平；接种量采用１．０％、２．０％、３．０％、４．０％四个水平。以发酵液活菌浓度为指标，确定出芽孢杆菌Ｚ－２７菌株最佳培养基组成及最适接种量［９，１０］。

１．３．３ 芽孢杆菌Ｚ－２７菌株生长曲线的测定 在组成优化后的发酵培养基中接入种龄为１０～１２ ｈ的芽孢杆菌Ｚ－２７菌株种子液，摇床转速１７０ ｒ／ｍｉｎ，摇瓶装液量５０ ｍＬ，接种量２．０％，３７ ℃培养２４ ｈ。每隔２ ｈ测定１次发酵液ＯＤ６００ ｎｍ值，记录测定时间及相应ＯＤ６００ ｎｍ值绘制芽孢杆菌Ｚ－２７菌株的生长曲线。

１．３．４ 建立ＢＰ人工神经网络模型 建立神经网络的图形用户界面：应用Ｍａｔｌａｂ７．２的ＧＵＩＤＥ功能创设了含有输入因子数据库、输出因子数据库、神经网络训练参数设置、隐含层数、隐含层的神经元数、训练函数、预测输入、预测结果、神经网络保存等多个功能的操作界面。

数据输入及网络初始化：导入玉米粉、豆饼粉、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ、ｐＨ、接种量５因素４水平的１６个试验值作样本输入，用专家相应评价结果作为输入样本对应的教师值，取精度ε＝０．０００ ０７，输入节点数为５，隐含层取５个节点，输出层取１个节点，以玉米粉、豆饼粉、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ、ｐＨ、接种量 ５因素为自变量，建立输入矩阵，以活菌浓度为因变量，建立输出矩阵，对数据网络初始化。

网络设置的训练参数为：最大训练步数为１０ ０００，学习效率为０．０２，训练误差目标为０，动量常数为０．０５，网络训练采用Ｌｅｖｅｂｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔ算法。

２ 结果与分析

２．１ 正交试验优化培养条件

２．１．１ 不同碳源对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株摇瓶发酵的影响 在摇瓶发酵基础培养基中分别加入１．０％的不同碳源，进行发酵试验，结果见表１。由表１可见，在培养基中以玉米粉和麸皮为碳源，活菌浓度均≥２．６×１０9 ＣＦＵ／ｍＬ，芽孢产率亦均≥９０％，发

酵液中抑菌物对大肠杆菌的抑菌活性也较高。其中以玉米粉为碳源时，相应的３个指标均表现为最高，故选择玉米粉为最佳碳源。

２．１．２ 不同氮源对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株摇瓶发酵的影响 以１．０％玉米粉为碳源，在摇瓶发酵基础培养基中分别加入１．０％的不同氮源进行发酵试验，结果见表２。由表２可见，在培养基中以豆饼粉或花生饼粉为氮源，活菌浓度均≥２．４０×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ，芽孢产率均≥９７％，发酵液中抑菌物的活性也较高，因此豆饼粉或花生饼粉均可作为最佳氮源。以下试验均选择以豆饼粉为氮源。

２．１．３ 不同无机盐对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株摇瓶发酵的影响 在摇瓶发酵基础培养基中以１．０％玉米粉为碳源，以１．０％豆饼粉为氮源，分别添加ＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ６种无机盐代替培养基中的ＣａＣｌ２，添加量均为０．０２％，考察不同无机离子对发酵的影响，不同无机离子对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株活菌数、芽孢产率和抑制大肠杆菌能力的影响结果见表３。由表３可见，Ｍｎ２＋对芽孢杆菌Ｚ－２７菌株的促进作用最强，故选择ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ作为无机盐。

２．１．４ 正交试验与结果 综合以上各单因素试验结果，选择玉米粉、豆饼粉、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ、ｐＨ、接种量 ５个因素，按正交试验表Ｌ１６（４５）设计试验（表４），结果见表５。

依据正交试验的直观分析结果，极差值大小为Ｒ豆饼粉＞ＲｐＨ＞Ｒ玉米粉＞Ｒ接种量＞Ｒ■，表明豆饼粉为主要影响因素，ｐＨ影响次之。由表５可见，７号试验组合发酵液的活菌数最高，为１．７０×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ，其组合为Ａ２Ｂ３Ｃ４Ｄ１Ｅ２，即玉米粉

２．０％、豆饼粉１．５％、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０７％，起始ｐＨ为６．５，接种量为２．０％。

２．２ 对主要因素进行仿真和优化分析

在正交试验所获得的较优组合的基础上，改变一种影响因素值，固定其他４种影响因素值，应用所建立的ＢＰ人工神经网络模型进行模拟，结果如图１至图５所示。

由图１至图５可知，固定其他４种影响因素值，改变一种影响因素值，所建立的ＢＰ人工神经网络模型进行数值仿真，确定获得Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７菌株培养基组分为：玉米粉２．０％、豆饼粉１．５％、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０７％、起始ｐＨ为７．０、接种量为２．０％。应用优化得到的最佳组分进行了３次验证试验，所得活菌浓度平均为１．８１×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ，优于正交试验结果。

３ 小结与讨论

１）利用正交试验数据对ＢＰ人工神经网络模型进行训练，测试样本的网络预测值和实际测量值的相对误差小于１％，训练好的模型可对提取结果进行预测。

２）将ＢＰ人工神经网络技术与传统的正交试验方法相结合，充分利用正交试验数据，并对主要影响因素进行仿真优化，获得Ｂａｃｉｌｌｕｓ vｅｌｅｚｅｎｓｉｓ Ｚ－２７菌株培养基组分：即玉米粉２．０％，豆饼粉１．５％，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０７％，起始ｐＨ为７．０，接种量为２．０％。

参考文献：

［１］ 王世英． 猪源抗腹泻芽孢益生菌的分离与Ｚ－２７菌株的鉴定［Ｊ］． 湖北农业科学，２００９，４８（５）： １２００－１２０３．

［２］ 沈 波，王李仁，许旭艳，等．应用ＢＰ神经网络模型预测福州市山区细菌性痢疾流行［Ｊ］．现代预防医学，２０１１，38（３）：４２３－424， ４２９．

［３］ 郝中华．ＢＰ神经网络的非线性思想［Ｊ］．洛阳师范学院学报，２００８（４）：５１－５５．

［４］ 区伟佳． 基于二次正交旋转回归优化大豆内拮抗菌ＡＦ－６７发酵工艺［Ｊ］．生物数学学报，２０１０，２５（４）：７０７－７１２．

［５］ 范会兰．抗犊牛腹泻益生菌株 ＢＮ－９ 产芽孢条件的优化［Ｊ］． 湖北农业科学，２００９，４８（２）：４０５－４０９．

［６］ 范会兰．抗犊牛腹泻益生菌株的筛选及其产芽孢和产抗菌蛋白条件优化［Ｄ］．成都：四川师范大学，２００９．

［７］ 蔡 云，张靖妤．基于ＢＰ神经网络优化算法的工业企业经济效益评估［Ｊ］．统计与决策，２０１２，３５８（１０）：６３－６５．

［８］ 褚以文．微生物培养基优化方法及其 ＯＰＴＩ 优化软件［Ｊ］．国外医药（抗生素分册），１９９９（２）：５８－６６．

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