巴曲酶对体外培养下内皮祖细胞数量及功能的影响

・２Ｏ６・　中华老年心脑血管病杂志２００８年３月第ｌ０卷第３期Ｃｈｉｎ　ＪＣ－ｅｒｉａｔｒＨｅａｒｔ　ＢｒａｉｎＶｅｓｓｅｌ　Ｄｉｓ，Ｍａｒ　２００８，ｖ（　１０，Ｎｏ．３　基础研究　巴曲酶对体外培养下内皮祖细胞　数量及功能的影响　孙小杰，胡何节，邓福生，王晓天　摘要：目的　探讨巴曲酶（ＤＦ－５２１）对内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ，ＥＰＣｓ）数量和功能的影响。方法　采　用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞，将其接种在细胞培养板中，分为对照组、低剂量干预组（ＤＦ－５２１　０．０５　ＢＵ／ｒｎ１）、中剂量干预组（Ｄ　５２１　０．１　ＢＵ／ｍ１）和高剂量干预组（ＤＦ－５２１　０．２　ＢＵ／ｍ１）。激光共聚焦显微镜鉴定　“ＦＩＴｃ标记的荆豆凝集素”和“ＤｉＩ标记的乙酰化低密度脂蛋白”双染色阳性细胞为正在分化的ＥＰＣｓ，流式细胞仪　检测其表面标记并进一步鉴定ＥＰＣｓ。ＭＴＴ比色法、改良的Ｂｏｙｄｅｎ小室及黏附能力测定ＥＰＣｓ的增殖、迁移和黏　附能力。结果　与对照组比较，不同浓度ＤＦ＿５２１干预组均随浓度增加明显提高ＥＰＣｓ的数量；中剂量干预组作用　２４　ｈ时对ＥＰＣｓ的数量影响最为显著，较对照组增加近１倍（Ｐ＜Ｏ．０５）。ＤＦ＿５２１对于ＥＰＣｓ的增殖、迁移、黏附能　力也有显著的改善（Ｐｄ０．０５）。结论中图分类号：Ｒ９７２　ＤＦ～５２１可增加体外培养条件下ＥＰＣｓ的数量并改善其功能。　文章编号：１００９—０１　２６（２００８）０３～０２０６—０４　关键词：巴曲酶；细胞，培氧的；干细胞；内皮祖细胞　文献标识码：Ａ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ＳＵＮ　Ｘｉａｏ—ｊｉｅ，ＨＵ　Ｈｅ—ｊｉｅ，ＤＥＮＧ　Ｆｕ—ｓｈｅｎｇ，ｅｔ　ａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ　Ａ　ｔ　ｔｔｌｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３０００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ（ＤＦ～５　２　１）ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｅｎｄｏ—　ｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ（ＥＰＣｓ）ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ＥＰＣｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ（ＭＮＣｓ）ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｂｙ　Ｆｉｃｏｌｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎ—　ｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｐｌａｔｅｄ　ｏｎ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ—ｃｏａｔｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈｅｓ．Ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　７　ｄ，ｔｈｅ　ａｔｔａｃｈｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＤＦ一５２１（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：０．０５，０．１，０．２　ＢＵ／　ｍ１）ｆｏｒ　６，１　２，２４　ａｎｄ　４８　ｈ．ＥＰＣｓ　ｗｅｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ａｓ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ＤｉＩ—ＬＤＬ—　ｕｐｔａｋｅ　ａｎｄ　ｌｅｃｔｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｕｎｄｅｒ　ａ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏ—　ｓｃｏｐｅ．ＥＰＣｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ　ｂｙ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ３４，ＶＥＧＦＲ一２　ａｎｄ　ＣＤ１３３　ｗｉｔｈ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＰＣｓ　ｗｅｒｅ　ａｓｓａｙｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂｏｙｄｅｎ　ｃｈａｍｂｅｒ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＥＰＣｓ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ｒｅｐｌａｔｉｎｇ　ｉｔ　ｏｎ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ—ｃｏａｔｅｄ　ｄｉｓｈｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｃｏｕｎｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＥＰＣｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＦ一　５２１　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　２４　ｈ　ａｆｔｅｒ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　０．１　ＢＵ／　ｍｌ　ＤＦ一５２１（２一ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ，Ｐ　ｄ０．０５）．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ。ＤＦ一５２１　ａｌｓｏ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｏｆ　ＥＰＣｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｄｅｆｉｎｅ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＦ一５２１：ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＥＰＣｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｖ　ｉｎ　缸ｒ０Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ；ｃｅｌｌｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ；ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　．　巴曲酶（ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ，ＤＦ一５２１）是一种由蝮蛇毒　基金项目：安徽省临床医学重点学科应用技术项目（０５Ａ０２７）　作者单位：２３０００１合肥，安徽医科大学附属省立医院　通讯作者：胡何节，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕｈｅｊｉｅ＠ｈｏｔｍａｉｌ，ｃｏｒｎ　液中提纯精制而成的丝氨酸蛋白，目前临床上广泛　用于包括脑梗死、慢性下肢动脉硬化性闭塞症　维普资讯 http://www.cqvip.com 中华老年心脑血管病杂志２００８年３月第ｌＯ卷第３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｇｅｒｉａｔｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｂｒａｉｎ　Ｖｅｓ￣ｌ　Ｄｉｓ，Ｍａｒ　２００８，Ｖｏｌ　１０，Ｎｏ．３　（ＡＳＯ）在内的各种缺血性疾病的治疗。内皮的损　伤与修复之间的动态平衡是维持其正常功能的关　键［１］，而血管内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ，ＥＰＣｓ）是参与修复的重要因素　ｊ。ＤＦ一５２１可　能通过影响ＥＰＣｓ促进内皮功能的改善，本实验通　过观察其对外周血ＥＰＣｓ数量、增殖、迁移和黏附能　力的影响，旨在进一步探讨ＤＦ一５２１的作用机制，并　为体外扩增ＥＰＣｓ寻找可能的诱导剂。　１材料与方法　１．１材料与试剂　人纤维连接蛋白（ＨＦＮ）购自　ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）购　自Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司；ＰＥ标记的ＶＥＧＦＲ一２、ＣＤ１３３单　克隆抗体购自ａｂｃａｍ公司；ＰＥ直标ＣＤ３４单克隆抗　体购自晶美公司；ＭＴＴ与ＤＭＳＯ购自ＬＶＳＨＥＧ—　ＮＹＵＡＮ公司；胰酶购自Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司；特级ＦＢＳ　与ＤＭＥＭ购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ＦＩＴＣ标记的荆豆凝　集素（Ｆ！ＴＣ—ＵＥＡ—Ｉ）购自Ｓｉｇｍａ公司，ＤｉＩ标记的乙　酰化低密度脂蛋白（ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ）购自ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅ公司，改良的Ｂｏｙｄｅｎ小室购自江苏海门麒麟　医用仪器厂。　１．２方法　１．２．１　ＥＰＣｓ的分离与培养　取肝素抗凝的健康　成人空腹外周静脉血２０　ｍｌ，加ＰＢＳ　２０　ｍｌ进行稀　释，按１：２置于淋巴细胞分离液上层，水平离心　２　０００　ｒ／ｍｉｎ，２５　ｍｉｎ后，提取分液层与上层交界部　位呈云雾状的灰白色层，即为单个核细胞层，５倍体　积的ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养液洗涤２次，依次以２　０００　ｒ／ｒａｉｎ和１　５００　ｒ／ｍｉｎ在室温下离心８　ｍｉｎ，弃上清，　再将获得的细胞接种在包被有ＨＦＮ的细胞培养瓶　中，用含２０　ＦＢＳ，ＶＥＧＦ（１０　ｕｇ／Ｌ），青霉素（１００　Ｕ／ｍ１），链霉素（１００　Ｕ／ｍ１）的ＤＭＥＭ培养液培养　至第４天时再用ＰＢＳ洗掉非贴壁细胞，换培养液继　续培养至第６天，ＰＢＳ洗掉非贴壁细胞，收集贴壁细　胞待用。　１．２．２　ＥＰＣｓ的鉴定　倒置显微镜下观察细胞的　形状及排列；将培养至第６天的一部分细胞用　０．２５　胰酶消化并加入培养液中和，ＰＢＳ充分洗涤　并吹打后制成每管１×１０。个细胞的单细胞悬液，加　ＰＥ直标的ＣＤ３４、ＣＤ１３３单克隆抗体和ＶＥＧＦＲ一２单　克隆抗体各１０　ｕｌ，ＰＢＳ洗涤重悬后用流式细胞仪分　析。ＣＤ３４、ＣＤ１３３和ＶＥＧＦＲ－２均以相应的同型　ＩｇＧ作为对照，阳性细胞率通过纠正对照的百分率　计算；将培养至第６天的细胞与ＤｉＩ—ａｃＩ　ＤＬ于３７℃　下共孵育１　ｈ，使细胞摄取ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ，再以２％多聚　甲醛固定细胞１０　ｒａｉｎ后，用ＰＢＳ浸洗，将ＦＩＴＣ—　ＵＥＡ—Ｉ加入其中，再于３７℃下孵育１　ｈ。多波长激　光共聚焦显微镜下观察荧光，以不加ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ的　同批培养细胞作空白对照，阴性对照采用胆管癌细　胞，ＦＩＴＣ－ＵＥＡ—Ｉ与ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ双染色阳性细胞为　正在分化中的ＥＰＣｓｌ＿２　］。　１．２．３　实验分组将培养至第６天的贴壁细胞消　化成细胞悬液，以１×１０　／ｍｌ的密度接种于２４孔　板，分为对照组（不加ＤＦ一５２１）、低剂量干预组　（ＤＦ一５２１　０．０５　ＢＵ／ｍ１）、中剂量干预组（ＤＦ一５２１　０．１　ＢＵ／ｍ１）和高剂量干预组（ＤＦ＿５２１　０．２　ＢＵ／ｍ１），４组　细胞培养２４　ｈ后，进行增殖及各项功能的测定，根　据结果选择差异较显著的剂量，再进行ＤＦ－５２１对　ＥＰＣｓ数量及功能影响的时效关系（干预前、干预后　６、１２、２４和４８　ｈ）实验。上述各组细胞干预２４　ｈ　后，在倒置相差显微镜下选取各组各孔具有典型梭　型形态的细胞计数，随机选择９个２００倍视野。　１．２．４　ＥＰＣｓ增殖能力的检测　各组细胞以　０．２５　的胰酶消化成细胞悬液，计数后以等量细胞　数接种于９６孔培养板，每孔加１００　ｕｌ　ＭＴＴ　（５　ｇ／Ｉ　），培养４　ｈ后，弃上清液，再加入ＤＭＳＯ（１５０　ｕｌ／￣Ｌ），充分振荡１０　ｒａｉｎ，使结晶物完全溶解，置酶　标仪上于波长４９０　ｎｍ测吸光度（Ａ）值。　１．２．５　ＥＰＣｓ迁移能力的检测　各组细胞以　０．２５　的胰酶消化成细胞悬液并计数，将１００　ｕｌ培　养液加入改良Ｂｏｙｄｅｎ小室的下室，再将２×１０　个　ＥＰＣｓ悬浮在５０　ｌ培养液注入上室，２４　ｈ后，刮去　滤膜上未移动的细胞，用甲醛固定，ＨＥ染色，在倒　置显微镜下随机选择９个２００倍视野计数。　１．２．６　ＥＰＣｓ黏附能力的测定　按上述收集各组　贴壁细胞，悬浮在１　ｍｌ培养液中并计数，再以同等　数量接种于ＨＦＮ包被的培养板，在３７℃中培养３０　ａｒｉｎ后，洗去未贴壁细胞，在倒置显微镜下随机选取　９个２００倍视野计数。　１．３统计学方法所有数据均采用ＳＰＳＳ　１３．０统　计软件进行分析，计量资料用。ｃ±　表示，组间资料　比较采用单因素方差分析，Ｐ　ｄ０．０５为差异有统计　学意义。　２　结　果　２．１　ＥＰＣｓ的鉴定　分离所得的单个核细胞培养至　第６天成为梭形的内皮样细胞（图１）；用ＦＩＴＣ—　ＵＥＡ—Ｉ和ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ染色后的细胞在激光共聚焦　显微镜下观察，双染色阳性细胞呈黄色（图２，３），提　示该细胞为正在分化中的ＥＰＣｓ；流式细胞仪分析　维普资讯 http://www.cqvip.com 中华老年心脑血管病杂志２００８年３月第ｌ０卷第３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｇｅｒｉａｔｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｂｒａｉｎ　Ｖｅｓｓｅｌ　Ｄｉｓ，Ｍａｒ　２００８，Ｖｏｌ　１０，Ｎｏ．３　显示培养至第６天表达ＣＤ３４、ＣＤ１３３和ＶＥＧＦＲ一２　的细胞分别为（１８．２±６．３）　、（２８．５±７．２）　和　（７７．０±６．４）　。　表２　中剂量干预组不同作用时间对ＥＰＣｓ　数量及功能的影响（ｘ±Ｓ，　一９）　注：与干预前比较，　Ｐ＜Ｏ．０５；与６　ｈ比较，　Ｐ＜Ｏ．０５；与１２　ｈ　比较，　Ｐ＜Ｏ．０５　图１　单个核细胞培养６天后贴壁细胞呈梭形　×２００　２．４　ＤＦ一５２１对ＥＰＣｓ迁移能力的影响　与对照组　比较，不同浓度干预组均能明显改善ＥＰＣｓ的迁移　能力，其中以中剂量组最为显著（Ｐ＜０．０５，表１），　并在干预２４　ｈ时差异最为显著（Ｐ＜０．０５，表２）。　２．５　ＤＦ一５２１对ＥＰＣｓ黏附能力的影响　与对照组　比较，不同浓度干预组均能增加贴壁ＥＰＣｓ的数量，　其中低剂量干预组作用最为显著（Ｐ＜０．０５）。并　图２，３激光共聚焦显微镜下荧光染色后的ＥＰＣｓ，双染色细胞　呈黄色ＦＩＴＣ－ＵＥＡ—Ｉ、ＤｉＬａｅＬＤＬ染色　×２００图２单个核细胞　也呈时间依赖关系影响ＥＰＣｓ，其中干预２４　ｈ时黏　附细胞数（５６．３±９．６）个／ｚｏｏ倍视野，而干预前为　（２６．３±８．３）个／２００倍视野，差异有统计学意义　培养６天后形态图３中剂量干预组干预２４　ｈ后细胞形态　２．２　ＤＦ－５２１对ＥＰＣｓ数量的影响　与对照组比　较，不同浓度干预组对ＥＰＣｓ干预２４　ｈ后，均随浓　度明显提高ＥＰＣｓ的数量，其中以中剂量干预组最　为显著（Ｐ＜０．０５，表１）。此外，中剂量干预组对　ＥＰＣｓ数量的影响随作用时间变化，其中干预至１２　ｈ　开始显著增加，２４　ｈ达高峰（Ｐ＜０．０５，表２）。用　ＦＩＴＣ—ＵＥＡ—Ｉ和ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ染色后的中剂量干预组　细胞在激光共聚焦显微镜下观察，数量明显高于干　预前（图２，３）。　２．３　ＤＦ一５２１对ＥＰＣｓ增殖能力的影响　与对照组　（Ｐ＜０．０５）。高剂量干预组和中剂量干预组黏附细　胞数与对照组比较，差异无统计学意义（表１）。　３讨　论　ＤＦ一５２１具有增强纤溶系统活性，改善血液流变　学各项指标，减少血栓基质形成等作用，其可诱发内　皮细胞释放组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ），使纤溶　酶原激活成纤溶酶而起溶栓作用，同时，还可分解血　纤维蛋白原，生成降解Ａ链纤维蛋白单体，该单体　对ｔ－ＰＡ促进血纤溶酶的生成有促进作用；ＤＦ一５２１　亦可降低血黏度，抑制红细胞聚集及沉降，增强红细　胞的血管通透性，变形能力、扩张血管而降低血管阻　力，从而改善微循环。有研究表明，ＤＦ一５２１对于缺　比较，不同浓度干预组均能明显提高ＥＰＣｓ的增殖　能力，其中中剂量干预组最为显著（Ｐ＜０．０５，表　１）。中剂量干预组ＥＰＣｓ的增殖能力呈时间依赖性　提高，２４　ｈ达峰值，４８　ｈ时较前有所下降（Ｐ＜　血后脑血管内皮细胞有着一定的保护作用ｒ４］，可能　表１　不同浓度ＤＦ　５２１对ＥＰＣｓ数量和功能的影响（ｘ±５，　一９）　注：与对照组比较，　Ｐ＜Ｏ．０５；与低剂量干预组比较，　Ｐ＜Ｏ．０５；与高剂量干预组比较，　Ｐ＜Ｏ．０５　维普资讯 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中华老年心脑血管病杂志２ＯＯ８年３月第１０卷第３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｇｅｒｉａｔｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｂｒａｉｎ　Ｖｅｓｓｅｌ　Ｄｉｓ，Ｍａｒ　２００８，Ｖｏｌ　１０，Ｎｏ．３　在内皮损伤后的修复中也有正性作用。　ＥＰＣｓ是一群具有分化为成熟内皮细胞并形成　血管腔能力的前体细胞，它们不仅参与胚胎时期血　管的形成，在出生后的血管新生和内皮损伤的再修　复过程中也起着重要作用，多项研究表明，新生血管　中的内皮细胞有２５　来源于循环ＥＰＣｓ［　。ＥＰＣｓ　在缺血性疾病的发生发展中的作用也备受关注，研　究表明，冠心病患者循环中ＥＰＣｓ的数量和迁移能　力明显下降，且与危险因子的数目呈反向线性关系，　而高危者体内的ＥＰＣｓ也易于老化＿】　。　Ａｓ（）是一种与冠心病有着相似发病机制的下　肢缺血性疾病。而自体ＥＰＣｓ的移植能够改善缺血　部位的血流供应［７。无疑ＥＰＣｓ在ＡＳ（）的发生发展　中同样扮演着重要的角色。　本研究结果显示。ＤＦ一５２１在体外培养环境中能　够有效的增加ＥＰＣｓ的数量，并增强其增殖、迁移、　黏附的能力，在中剂量干预组中，ＤＦ一５２１对于ＥＰＣｓ　数量和功能的改善尤为明显。因此我们在此剂量组　又进行了时效关系的实验，结果提示作用时间与　ＥＰＣｓ增殖能力的改善呈正相关，２４　ｈ时作用最为　显著；而在３６　ｈ时呈下降趋势，这可能由于在干预　的前２４　ｈ中ＥＰＣｓ处于细胞增殖周期中，而随着培　养和干预的继续，细胞逐渐进人分化阶段，此时增殖　和其他功能可能处于相对抑制中。在ＥＰＣｓ黏附能　力的测定中，只有低剂量干预组体现出了正性作用，　这可能是ＤＦ一５２１在“增强细胞功能”和“加强纤溶　活性”两方面的消长关系的体现，因为ＥＰＣｓ的黏附　对于纤维蛋白有着一定的依赖关系。　本研究结果显示：关于ＤＦ一５２１对于体外ＥＰＣｓ　的影响，在临床实际应用中，由于ＤＦ一５２１作用于体　内，尚存在有关消除和血药浓度衰减等多种因素的　影响，所以不能确定实验结果中体现出的量效和时　效关系是否与临床应用完全统一，且本实验外周血　来源单一，存有一定抽样误差，但提示了ＤＦ一５２１对　于体外ＥＰＣｓ扩增具有应用的潜力，同样提示了　ＤＦ一５２１其对于缺血性疾病的保护作用可能通过增　加ＥＰＣｓ的数量，改善其功能，从而促进内皮的修复　和血管的新生。　ＥＰＣｓ是较好的组织工程的内皮来源种子细　胞ｌ８　。但由于循环内ＥＰＣｓ数量极少，所以想分　离培养出大量较纯的ＥＰＣｓ目前仍相当困难。如果　能把ＤＦ一５２１应用于体外ＥＰＣｓ的扩增，将可能为组　织工程或干细胞移植提供良好并具一定数量的种子　细胞。ＤＦ一５２１增加ＥＰＣｓ数量并改善其功能的具　体机制尚待进一步研究，可能与以下几种因素有关：　（１）减少ＥＰＣｓ的凋亡；（２）上调ＥＰＣｓ整合素的表　达，提高ＥＰＣｓ的黏附能力；（３）上调增殖细胞核抗　原等细胞周期促进蛋白在基因和蛋白水平上的表　达，从而促进ＥＰＣｓ的增殖；（４）下调细胞周期抑制　蛋白Ｐ２７的表达，从而抑制ＥＰＣｓ的衰老，并通过其　他信号转导途径影响细胞的分化和增殖。　参考文献　［１］Ｈｉｌｌ　ＪＭ，ＺａｌｏｓＯ，ＨａｌｃｏｘｊＰ，ｅｔ　ａ１．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏ—　ｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ，ｖａｓｃｕｌａｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｒｉｓｋ．Ｎ　Ｅｎ—　ｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，２００３，３４８：５９３—６００．　［２］Ｌａｍｂｉａｓｅ　ＰＤ，Ｅｄｗａｒｄｓ　ＲＪ，Ａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｈｕｍｏｒａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００４，　１０９：２９８６—２９９２．　Ｅ３］Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｃｈｅｎ　Ｊ，ＴＡＯ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｏｘ－ＬＤＬ　ｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｄｒｕｇ　Ｃｈｅｍ　Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００４，２７：２４３—２５５．　Ｅ４］吴军，饶明俐，周春奎．巴曲酶对大鼠ＳＡＨ后迟发性脑血管　痉挛细胞凋亡的影响．中风与神经疾病杂志，２００４，２１：２１７—　２１８．　Ｅ５］Ｍｕｒａｙａｍａ　Ｔ，Ｔｅｐｐｅｒ　ＯＭ，Ｓｉｌｖｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ａｎｇｉｏｇｅｎｉｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅ０ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉ０ｎ　ｎ　ｖｉｖｏ．Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００２，３０：９６７—９７２．　Ｅ６］　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｔ，Ｎｉｓｈｉｄａ　Ｍ。Ｆｕｔａｍｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅ０ｅｎｄ０ｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉ０ｎ　ａｆｔｅｒ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ０ｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ：ａ　ｅａｓｅ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ａ　Ｔｏｋａｉｍｕｒａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｃｉｄｅｎｔ　ｖｉｃｔｉｍ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｅ　Ｒｅｓ，２００３，５８：４８７－４９２．　Ｅ７］Ｊｅｏｎ　０，Ｓｏｎｇ　ＳＪ，Ｂｈａｎｇ　ＳＨ，ｅｔ　ａ１．Ａｄｄｉｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ—　ａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｎｕｅｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ０ｎ　ｏｎ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｌｉｍｂｓ．　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｓｅｉ，２００７，１４：３２３～３３０．　Ｅ８］Ａｐｅｒ　Ｔ，Ｓｃｈｍｉｄｔ　Ａ，Ｄｕｅｈｒｏｗ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｂｌｏｏｄ　ｖｅｓ—　ｓｅｌｓ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｖａｓｅ　Ｅｎ—　ｄｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ，２００７，３３：３３—３９．　［９］Ｗａｎｇ　ＸＸ，Ｚｈａｎｇ　ＦＲ，Ｓｈａｎｇ　ＹＰ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ［】ｎ　ｏｆ　ａｕ—　ｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｍａｙ　ｂｅ　ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ　ｉｎ　ｐａ—　ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｈｙｐｏｒｔｅｎｓｉｏｎ：ａ　ｐｉｌｏｔ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｅｏｏｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｒｉａ１．Ｊ　Ａｍ　Ｃｏｉｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ，２００７，４９：１５６６—　１５７１．　［１０］Ｔｓｅ　ＨＦ，Ｓｉｕ　ＣＷ，Ｚｈｕ　ＳＯ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｒａｅｒｉｎｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎ—　ｔｒａｍｙｏｅａｒｄｉａｌ　ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｌｌ　ｔｏ　ｅｎ—　ｈａｎｅｅ　ｎｅ０ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉ０ｎ　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｓｅｈｅｍｉｅ　ｍｙｏｅａｒｄｉｕｍ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｈｅａｒｔ　Ｆａｉｌ，２００７，９：７４７—７５３．　（收稿日期：２００７—０８—２０）　（本文编辑：唐丽君）