改进植物油黄曲霉毒素B1测定的前处理方法

改进植物油黄曲霉毒素B1测定的前处理方法

作者：邓云 周新华

来源：《中国科技纵横》2016年第16期

【摘 要】黄曲霉毒素B1在自然界广泛存在，具有强烈的致癌性，其是黄色曲霉菌（Aspergillus flavus）或寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）的主要次生代谢产物，是目前已知的自然物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1毒性剧烈，致癌性强，即使含量非常少，通过生物积累，也能引起人体器官癌变，所以国内外对其限量标准以及检验方法都做了严格和深入的研究，但是常用的检验前处理方法步骤繁琐，费时费人力，消耗大量的试剂，且灵敏度低。通过尝试利用恒温振荡器和特制的塑料振荡架进行植物油的前处理，用酶联免疫方法对样品中黄曲霉毒素B1进行检测，大大提高了检验速度、检出限，降低了成本，对于一般的样品可加提取液直接测定，具有很高的灵敏度。

【关键词】植物油 黄曲霉毒素B1 前处理黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。而使用黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素B1残留。参考国家标GB/T5009.22-2003。黄曲霉毒素B1检测试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代真菌毒素检测产品，相比起薄层层析法操作时间短于60min，能最大限度地减少操作误差和工作强度，提高了试验灵敏度，且安全无污染。 1 试验材料与方法 1.1 主要材料

板式酶标仪；恒温孵育箱；梨形分液漏斗（250ml）；恒温振荡器；特制20孔振摇架，50ul-1000ul移液枪。 1.2 主要试剂

石油醚（分析纯，沸点60-90）；1+1甲醇水；ELISA定量检测试剂盒（苏菲内含AFB1抗原包被12孔x2条形戴康酶标板；抗原稀释液；抗原；样品稀释液；显色液ab；终止液；洗液；标准液。 1.3 操作步骤 1.3.1 前处理步骤

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（1）梨形分液漏斗涂好凡士林，编号，称取5g左右样品于梨形分液漏斗中。 （2）分别加入20ml石油醚和25ml1+1甲醇水溶液。

（3）用适宜的胶塞紧塞梨形分液漏斗，按顺序倒立于特制的20孔振荡架（刚好可以固定梨形分液漏斗）中，再把振荡架嫁置于恒温振荡器上。

（4）打开恒温振荡器电源开关和振荡开关，调好左右摇晃的速度，振摇15分钟左右。 （5）取下分液漏斗胶塞，静置片刻后，扭到活塞，放下下层的甲醇水溶液于一次性杯内。

（6）用移液枪按样品顺序分别移取300ul样品液于10ml安培瓶内，再加入900ul样品稀释液于样品液内摇匀备用。 1.3.2 试剂盒处理步骤

（1）将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

（2）取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃，不要冷冻。

（3）洗涤工作液在使用前也需回温，且按20：1的配比配制洗液。 （4）编号：将样本和标准品对应微孔按序编号。

（5）加标准品/样本：在标准孔内加入从低到高浓度的标准液各50ul，再在样品孔加入样品液50ul后，再加入AFB1抗原试剂50ul/孔，轻轻振荡混匀，放置入恒温孵育箱内孵育30min。

（6）洗板：小心拿出反应板，将孔内液体用力甩干，吸取洗涤工作液250ul/孔，充分洗涤4次，每次间隔2分钟，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

（7）显色：加入底物液A液50ull/孔，再加底物液B液50ul/孔，轻轻振荡混匀，再放置恒温孵育箱避光环境反应15～20min。 （8）终止反应：加入终止液50ul，摇匀。

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（9）测定：设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。（若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定）。 2 结果与讨论 2.1 结果计算

以酶标仪测出的OD相对值为Y轴，输入酶标仪计算原件内，并编辑好稀释倍数以及标准曲线浓度，用对照标准曲线图，得出样品的AFB1的lgX值，求出X值，及为样品中AFB1含量。

2.2 结果验证

用液相色谱法处理同一样品，与本法得出的实验结果不大。 3 操作注意事项

（1）室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 （3）每加一种试剂前需将其摇匀。

（4）反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

（5）不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 （6）保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

（7）试剂变质的迹象，发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm

（8）在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15～20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到30min（或更长）。反之，则减短反应时间。 （9）浓缩洗涤液如有结晶属正常现象，请加热溶解后使用。

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（10）该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。 4 结语

国标植物油中黄曲霉毒素B1的测定前处理方法繁琐，耗时长，而且要每个样品需要摇荡5分钟，费人力。通过对其前处理方法进行改进，在操作过程中利用恒温振荡器和特质的震摇架从而可以批量处理样品，进而用酶联免疫方法对其测定，大大缩短了实验时间。