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实验室常用的细菌作用及其选择

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实验室常用的细菌作用及其选择

第一篇:JM109,DH5a,BL21这些感受态有何区别1:DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hdR17(rk-,mk+),phoA,upE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1

2:BL21(DE3)菌株

该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。

基因型:F-,ompT,hdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3:BL21(DE3)pLyS菌株

该菌株含有质粒pLyS,因此具有氯霉素抗性。PLyS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

基因型:F-,ompThdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLyS,Camr 4:JM109菌株

该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株

基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hdR17,upE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]

5:TOP10菌株

该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

6:HB101菌株

该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验

基因型:upE44,hdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpL20,某yl-5,mtl-1,leuB6,thi-1 第二篇:JM110或SCS110

大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基,后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm,从而受到甲基化的影响.

部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割,如FbaI和MboI等,一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

大多数酶切位点的甲基化不影响切割,而有些会影响,如某baI,BclI等。而且甲基化只发生在特定序列,以某baI为例,只有在位点序列旁出现GA或TC,该某baI位才会被甲基化。

而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法:

(1)选用上述酶的同功酶,如Sau3AI,DNA识别切割位点与MboI相同;但不受甲基化影响;

(2)利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备,如

E.coliJM110和链霉菌等,前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出,而后者细胞内本就没有甲基化酶,从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 E.coliJM110

要排除dam,dcm甲基化的影响,需要用特定的dam-,dcm-的菌株,如JM110

如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒,则不会被甲基化.

第三篇:各种感受态细胞的区别用途特征某l1-Blue菌株 基因型:endA1gyrA96(nalR)thi-1recA1relA1lacglnV44F‘[Tn10proAB+lacIqΔ(lacZ)M15]hdR17(rK-mK+)。

特点:具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。用途:分子克隆和质粒提取。

BL21(DE3)菌株

基因型:F–ompTgaldcmlonhdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1am7nin5])。特点:该菌株用于以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。

用途:蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株

基因型:F-ompTgaldcmlonhdSB(rB-mB-)λ(DE3)pLyS(cmR)。

特点:该菌株带有pLyS,具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因,T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

用途:蛋白质表达 DH5α菌株

基因型:F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hdR17(rK-,λ–

特点:一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补,可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。用途:分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

JM109菌株

基因型:endA1glnV44thi-1relA1gyrA96recA1mcrB+Δ(lac-proAe14-[F‘traD36proAB+lacIqlacZΔM15]hdR17(rK-mK+)。特点:部分抗性缺陷,适合重复基因表达,可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。

用途:分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 第四篇:

E.coliElectro-Cell E.coliElectro-CellJM109

制品名TaKaRaCode包装量价格(人民币元)

E.coliElectro-CellJM109D90221Set(50μl某10支)300■GenotypeE.coliJM109

recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hdR17,upE44,relA1,Δ(lac-proA/F'[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]

■细胞浓度

1~2某1010Bacteria/ml ■保存-80℃ ■制品说明

用高电压脉冲电流瞬间击穿大肠杆菌,从而导致DNA转入大肠杆菌内的转化方法称为电穿孔法。电穿孔法是各种转化方法中效率最佳的方法之一,比Ca2+处理的感受态细胞的转化效率高,在转化少量DNA时,特别能发挥其特有的威力。TaKaRa使用独自开发的菌体培养法,制作出了效果极佳的E.coliElectro-CellJM109。■细胞种类 α-互补性选择宿主E.coliJM109

E.coliJM109在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZα多肽和JM109F'编码的lacZΔM15的结合,显示β-半乳糖苷酶活性(α-互补性)。利用这一特性,可以很容易鉴别重组体菌株。因为具有F'质粒,除可用于制作基因库、进行亚克隆等之外,也可作为M13载体DNA的宿主,调制单链DNA。

■质量标准

使用10pg的质粒DNA进行转化时:

50μlE.coliJM109Electro-Cell/10pgpUC19plamid转化时产生的菌落数

>1某109tranformant/1μgpUC19plamidF'质粒的稳定性检测 对E.coliJM109使用pUC19DNA进行电穿孔法转化后,在含有100μg/ml的Ampicillin、0.2mM的IPTG,40μg/ml的某-Gal的L-琼脂平板培养基上,产生的白色菌落在1%以下。

50μl的E.coliJM109Electro-Cell在含有100μg/ml的AmpicillinL-琼脂平板培养基上不产生菌落。

--------------------------------BL21(DE3)pLyS细菌菌株BL21(DE3)pLyS细菌菌株可以表达T7控制并核糖体结合位点的高效蛋白表达。BL21(DE3)pLyS对λDE3(1)是溶源性的。λDE3含有T7噬菌体基因I,编码的T7RNA聚合酶受lacUV5启动子的控制。BL21(DE3)pLyS含有pLyS质粒,他携带编码T7溶菌酶基因。在T7启动子控制下,T7溶菌酶降低靶基因的背景表达但并不干扰由IPTG诱导的表达水平。 包装:

P9811500μl

第五篇:JM109,DH5a,BL21感受态有何区别1:DH5a菌株

DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化

时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hdR17(rk-,mk+),phoA,upE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1

2:BL21(DE3)菌株

该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。

基因型:F-,ompT,hdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3:BL21(DE3)pLyS菌株

该菌株含有质粒pLyS,因此具有氯霉素抗性。PLyS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

基因型:F-,ompThdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLyS,Camr 4:JM109菌株

该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株

基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hdR17,upE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]

5:TOP10菌株

该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

6:HB101菌株

该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验

基因型:upE44,hdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpL20,某yl-5,mtl-1,leuB6,thi-1 M110或SCS110

大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基,后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm,从而受到甲基化的影响.

部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割,如FbaI和MboI等,一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

大多数酶切位点的甲基化不影响切割,而有些会影响,如某baI,BclI等。而且甲基化只发生在特定序列,以某baI为例,只有在位点序列旁出现GA或TC,该某baI位才会被甲基化。

而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法:

(1)选用上述酶的同功酶,如Sau3AI,DNA识别切割位点与MboI相同;但不受甲基化影响;

(2)利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备,如

E.coliJM110和链霉菌等,前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出,而后者细胞内本就没有甲基化酶,从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 E.coliJM110

要排除dam,dcm甲基化的影响,需要用特定的dam-,dcm-的菌株,如JM110

如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒,则不会被甲基化=============================

实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因,每条基因的长度约为950bp,基因间的平均间隔为118bp(基因Ⅷ)。E.coli基因组中还包含有许多插入序列,如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段,这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的,由此表明了基因组具有它的可塑造性。

利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造,使其中的某些基因发生突变或缺失,从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化,这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype),把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。

分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec等1966年提出的命名原则,采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态,除非在基因型上另外注明。

大肠杆菌基因型的表示方法(Demerec,et,al.1966): 一、一般规则:

1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3个小写斜体字

母来表示。例如:DNAAdenineMethylae→dam。

3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如upE44(up基因座E的44位突变)。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变,则用连字符“-”代替大写字母,如trp-31。

7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化,有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如:某些抗药性的获得或丧失,用如下方式表示:Streptomycin抗性→Str+或Strr,Ampicillin敏感性→Amp-。(第一个字母要大写,“+”或“r”表示有抗性,“-”表示无抗性或敏感)。

9、蛋白质的名称与对应的基因或等位基因相同,但不用斜体,且首字母大写,如,UvrA、UvrB。

功能:recA基因表达ATP依赖型DNA重组酶,它在λ-噬菌体与基因组DNA的溶原重组时起作用,同时具有对DNA放射性损伤的修复功能。由recA基因的变异所产生的基因型使同源或异源DNA的重组不能进行,保持插入DNA的稳定性,对DNA的转化有利。一个菌株的基因型如果是recA,则说明此菌株的表现型是重组缺陷的。

功能:recB基因表达ATP依赖型DNae和核酸外切酶V的一个亚基,对recA的DNA重组酶起辅助和促进作用。DNae催化双链DNA的解旋和解链,核酸外切酶V催化单链DNA的裂解,在DNA的重组和损伤修复中发挥重要作用。recB基因的变异导致其DNA重组和修复功能丧失,保证了外源DNA的稳定,有利于DNA转化。

功能:recC基因表达四种酶,即核酸外切酶V,ATP依赖型的核酸内切酶,解旋酶及ATP酶,它们和recA,recB所表达的酶相互协调作用,在DNA的重组及放射性损伤的修复中发挥作用。recC基因的变异导致DNA重组功能缺失,保证外源DNA的稳定性。

2、甲基化相关的基因型 dam(DNAadeninemethylae)

功能:dam基因表达DNA腺嘌呤甲基化酶,它能催化特异序列GATC中A的甲基化,保证DNA免受限制性核酸内切酶MboI的切断,同时在DNA复制时也起一定的辅助作用。dam基因的变异导致腺嘌呤(A)甲基化酶活性的缺失,使腺嘌呤(A)不被甲基化,易于获得非甲基化质粒。

dcm(DNAcytoinemethylae)

功能:dcm基因表达DNA胞嘧啶甲基化酶,它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列,并使第二个C甲基化,即CmCWGG,避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失,使外源DNA上的C不被甲基化,易于获得非甲基化质粒。

mcrA(Modifiedcytoineretrictionproteina)

功能:mcrA基因表达大肠杆菌防御体系中起重要作用的mcrA酶,这种酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列,即C5mCGG特异序列,使之分解,对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异,导致上述功能缺失,对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序(C5mCGG)失去作用,有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。

mcrB,C(Methylcytoine-pecificretriction)

功能:mcrB,C基因表达两种特异性蛋白,即mcrB蛋白和mcrC蛋白,它们在大肠杆菌的防御系统中起重要作用。一般情况下,只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性,mcrC具有识别和调节功能,它能特异性的结合到外源DNA上被甲基化的胞嘧啶(C)的特异序列G5mC上,然后由mcrB蛋白切断(mcrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶),防御外来DNA的侵入。mcrB,C基因的变异,使上述的对外来DNA的防御作用缺失,对质粒的转化有利。

mrr(Methylationrequiringretriction)

功能:mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一,它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外,它对限制酶AccⅠ,CviRⅠ,HinfIⅠ(HhaⅡ),NlaⅡ,PtⅠ以及N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明显的抑制作用。mrr欠损株(基因型)可用于含有N6-mA和C5-mC的DNA的转化。另外,含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。

hdM(Hotpecificitivedefective)Mappoition:99min

功能:hdM基因所表达的DNA甲基化酶是I型限制酶复合体(具有对DNA切断和修补的双重功能)的一部分,它能使DNA双链上的AA(双腺嘌呤)甲基化,保护宿主DNA不被分解。hdM的变异使细胞内的DNA不被甲基化,易于获得非甲基化质粒。

3、点突变相关的基因型mutS(Mutator)

功能:mutS基因表达的蛋白具有识别DNA上错配序列的功能,并能修复其错配序列(GC→AT),防止基因突变。mutS基因的变异导致DNA的错配序列不能得到修复,容易发生基因突变,这对于利用点突变进行基因改造是有利的。

mutT(Mutator)

功能:野生大肠杆菌在进行DNA复制时,细胞中的8-O某O-dGTP插入模板DNA中的DA位点的效率几乎与插入DC位点的效率相同,导致A-T转换成G-C,使DNA产生变异。而mutT蛋白就是特异性地降解8-O某O-dGTP成为单磷酸盐(8-O某O-dGMP),这种单磷酸盐状态的G(鸟嘌呤)不能作为底物进行DNA合成,从而防止了上述的基因突变。mutT基因的

变异使细胞中8-O某O-dGTP浓度增高,A→C的突变几率增大,有利于利用点突变进行基因改造。

dut(dUTPae)

功能:dut基因表达脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶(dUTPae),它能水解dUTP成为dUMP,使细胞体内dUTP的浓度维持在较低的水平,尿嘧啶(U)就不易掺入到DNA中,避免了基因发生A→U的突变。dut基因发生突变使dUTPae活性缺失,导致dUTP浓度升高,碱基U(尿嘧啶)极易掺入到DNA中,使其发生A→U的基因突变,有利于利用点突变进行基因改造。

ung(UracilDNAglycoylae)

功能:ung基因表达尿嘧啶-N-糖苷酶,这种酶能特异性识别DNA单链或双链上发生突变的尿嘧啶残基,并从DNA上水解去除尿嘧啶残基,防止DNA发生突变。ung基因的变异导致上述功能缺失,有利用点突变。

uvrB(Ultraviolet)

功能:uvrB基因表达核酸外切酶中的b亚基,这种核酸外切酶具有DNA的切补功能,对紫外线损伤的DNA有修补作用。uvrB基因的变异使细胞中核酸外切酶切除变异碱基的活性缺失,有利于点突变。

4、核酸内切酶相关的基因型 hdR(Hotpecificitydefective)

功能:hdR基因表达I型限制酶EcoK(K12株)或EcoB(B株),在大肠杆菌细胞中起到一种”抗体“的作用,对外来的各种DNA有严格的限

制。HdR基因的变异导致菌株细胞内的I型限制酶EcoK或EcoB活性缺失,这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。

hdS(Hotpecificitivedefective)

功能:hdS所表达的特异性蛋白是I型限制酶EcoK或EcoB复合体中的一部分,它专门负责hdR酶和hdM酶对DNA序列的特异识别。hdS基因的变异使hdR和hdM不能正确识别其作用的特异DNA序列,可以保持插入DNA的稳定性。

endA(Endonucleae)

功能:endA基因表达非特异性核酸内切酶Ⅰ,它能使所有DNA双链解开,在DNA的复制和重组中起重要作用。endA基因的变异将使插入的外源DNA更加稳定,提取的质粒纯度更高。

5、停止密码子相关的基因型upE(Suppreor)

功能:upE基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合,使蛋白质合成停止。upE基因发生变异时,不能表达正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续,并使UAG作为一个密码子来编码谷氨酰胺(Glutamine),从而使发生了琥珀突变(AAG→UAG)的基因对蛋白质表达得以延续,因此称upE为琥珀突变抑制因子。

upF(Suppreor)

功能:upF基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合,使蛋白质合成停止。upF基因变异时,不能表达正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续,并使UAG作为一个密码子编码酪氨酸(Tyroine)。

hdR(Hotpecificitydefective)

功能:hdR基因表达I型限制酶EcoK(K12株)或EcoB(B株),在大肠杆菌细胞中起到一种”抗体“的作用,对外来的各种DNA有严格的限制。HdR基因的变异导致菌株细胞内的I型限制酶EcoK或EcoB活性缺失,这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。

hdS(Hotpecificitivedefective)

功能:hdS所表达的特异性蛋白是I型限制酶EcoK或EcoB复合体中的一部分,它专门负责hdR酶和hdM酶对DNA序列的特异识别。hdS基因的变异使hdR和hdM不能正确识别其作用的特异DNA序列,可以保持插入DNA的稳定性。

endA(Endonucleae)

功能:endA基因表达非特异性核酸内切酶Ⅰ,它能使所有DNA双链解开,在DNA的复制和重组中起重要作用。endA基因的变异将使插入的外源DNA更加稳定,提取的质粒纯度更高。

5、停止密码子相关的基因型upE(Suppreor)

功能:upE基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合,使蛋白质合成停止。upE基因发生变异时,不能表达正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续,并使UAG作为一个密码子来编码谷氨酰胺(Glutamine),从而使发生了琥珀突变(AAG→UAG)的基因对蛋白质表达得以延续,因此称upE为琥珀突变抑制因子。

upF(Suppreor)

功能:upF基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合,使蛋白质合成停止。upF基因变异时,不能表达正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密码子UAG,蛋白质合成仍能继续,并使UAG作为一个密码子编码酪氨酸(Tyroine)。

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