响应曲面法优化有机溶剂萃取雨生红球藻中虾青素_赵晓燕

响应曲面法优化有机溶剂萃取雨生红球藻中虾青素

赵晓燕1*，朱海涛1，1，毕玉平2，王兴军2

1. 济南大学酒店管理学院（济南 250022）；2. 山东省农业科学院生物技术研究中心（济南 250100）

摘要采用混合有机溶剂提取雨生红球藻中的虾青素, 响应面法用来建立模型和优化提取条件, 研究了单因素 (提取溶剂、温度、料液比与时间) 对虾青素提取率的影响。再通过响应面试验, 研究了料液比、温度和时间对虾青素提取率的影响, 且检测了相互作用关系。利用统计分析和优化, 结果显示, 对虾青素作用的相对大小依次为: 温度、料液比和时间。通过计算回归方程优化得出料液比、提取温度和提取时间最佳萃取条件分别为1︰150 (g/mL), 50 ℃和40 min。在此条件下, 虾青素提取率为36.21%。关键词

雨生红球藻; 虾青素; 响应面法；优化

Extraction of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis in Mixed Organic Solvent by

Response Surface Methodology

Zhao Xiao-yan1*, Zhu Hai-tao1, Chen Jun1, Bi Yu-ping2, Wang Xing-jun2

1. School of Hotel Management, University of Jinan (Jinan 250022);

2. Bio-tech Research Centre, Shandong Academy of Agricultural Sciences (Jinan 250100)

Abstract The mixed organic solvent was applied to extract the astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Response surface methodology (RSM) was used for modeling and optimizing the process, and to gain a better understanding of the process performance. The condition was selected based on relevant parameters for the astaxanthin, such as organic solvent, radio of solution to material, temperature and time. Through RSM, the effects of radio of solution to material, temperature and time on the extraction effi ciency were calculated and the interactions were determined. After statistical analysis and process optimization, the results showed that the effect of the extraction condition was temperature＞radio of solution to material＞time, and the optimum condition was that radio of material to solution 1︰150 (g/mL), temperature 50 ℃ and time 40 min, the assignment of astaxanthin was 36.21%.

Keywords Haematococcus pluvialis; astaxanthin; response surface methodology; optimization

虾青素（astaxanthin）是一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄质、虾黄素或龙虾壳色素，分子式与分子量分别为C40H52O4与596.86，色素颜色为红色，难溶于水，易溶于丙酮、氯仿、甲砜、苯和二硫化碳等有机溶剂，属于萜烯类含有不饱和化合物，主要在于虾、蟹、鱼、鸟类的羽毛、某些藻类及真菌中等含有[1]。其化学结构组成为直链结构由4个异戊二烯单位以共轭双键型形式联结，在两端又有2个异戊烯单位组成六节环结构，主要以反式结构存在。由于虾青素特殊的化学结构，在提取、加工处理和保藏过程中，光、热、氧化物、碱及表面活性剂使它易氧化和异构化[2]。

早在20世纪30年代，虾青素来源主是是从虾、蟹壳中分离出来，直到20世纪80年代中期才对其生物学功能进行广泛研究。研究表明，虾青素伸展的共轭双键使其具有颜色，主要生理功能作用为以下几点：（1）抗癌作用、抗氧化作用，其抗脂肪氧化的能力是β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等胡萝卜素的10倍，是天然维生素E的550倍，是花青素OPC的17倍，故称为超级抗氧化剂；（2）着色能力强；（3）增强免疫的功能；（4）对心血管系统有显著的保护作用，可能有效地预防与年龄相关的视黄斑退化和中枢神经系统疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤），故是老年人保健品的首选产品[3]。

虾青素可通过天然藻类、化学合成、生物方法及虾蟹壳等中提取。天然藻类提取获得虾青素的酯类的含量很高，易吸收，抗氧化能力强；化学合成及发酵生成的虾青素往往着色性和抗氧化能力弱。从虾蟹壳中提取成本高昂，且造成环境污染，而大家公认为雨生红球藻是自然界中生产天然虾青素的最好生物[4]，特别是美、日等发达国家均有大规模机械化雨生红球藻养殖和天然虾青素提取工业，我国虽然也生产天然虾青素，但规模较小。因此，藻类制备虾青素是前景看好的生产工艺路线，已成为近年来国际上天然虾青素生产的研究热点。

国内对虾青素的研究与国外相比，差距还很大。目前，利用雨生红球藻提取虾青素的方法主要有超临

124 2014 年第35卷第 10 期《食品工业》*通讯作者；基金项目：国家科技支撑计划课题（2012BAD33B00），山东

省科技发展计划（2011GGC02044），泰山学者建设工程专项经费资助

工艺技术

界CO2流体萃取法、有机溶剂萃取法、碱提法、酶法等[5-8]。由于虾青素为脂溶性色素，常用方法为有机溶剂浸提法，溶剂的选择既要考虑到虾青素的溶解度，又要考虑到它的极性，极性太弱不利于溶剂向细胞内渗透，因此一般选用混合溶剂。

虾青素的提取率一直较低，有待于深入的研究，为工业化生产提供可靠的依据参数。在前人研究的基础上，利用有机溶剂法提取虾青素，改进工艺条件，研究了混合有机溶剂比例、温度与时间影响虾青素的提取率，采用响应面试验，建立萃取数学模型，确定虾青素提取率较高的提取条件。

处理系统设计3因素3水平Box-Behnken响应面试验设计，如表1所示。

表1 Box-Behnken设计因子水平及编码

因素料液比/(g・mL)提取温度/℃提取时间/min

-1

编码X1X2X3

-11︰503040

水平01︰1004060

11︰1505080

2 结果与分析

2.1 溶剂、料液比、提取温度和提取时间对虾青素提取率的影响

图1展示了五种不同的溶剂体系提取的虾青素含量，进行比较可知，用乙酸乙酯的提取率为34.1%，用乙酸乙酯和乙醇体积比为1︰2的提取率为34.95%，这两种提取溶剂对虾青素提取效果没有明显的差异，用乙醇的提取率最低（18.5%），最终提取溶剂确定为乙酸乙酯和乙醇混合溶剂体积比为1︰2。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

虾青素标准品：Sigma公司；雨生红球藻粉（虾青素含量为2%）：荆州天然虾青素有限公司；乙醇、乙酸乙酯等化学试剂为分析纯。

移液：Eppendorf；恒温振荡水浴HZ3-H；哈尔滨东联电子技术开发有限公司；高速冷冻离心机CR22DⅢ：日本日立公司；紫外可见分光光度计UV-3300：日本Hitachi公司。1.2 试验方法

1.2.1 虾青素的提取工艺

溶剂法萃取分离虾青素主要工艺是先将雨生红球藻粉粉碎，用混合有机溶剂萃取，实现虾青素的分离。工艺流程如下：

混合有机溶剂 沉渣综合利用 ↘ ↗

雨生红球藻粉→震荡→离心分离（4 000 r/min）→虾青素提取液→分光光度检测虾青素含量1.2.2 虾青素萃取率的计算

根据文献建立虾青素标准曲线方程为：y= 0.815x-0.003 4，R2=0.995 2[9]。

1.2.3 有机溶剂萃取虾青素的单因素试验

称取雨生红球藻粉200 mg，分别加入20 mL不同体积比的溶剂乙酸乙酯和乙醇（乙酸乙酯和乙醇体积比为1︰1、乙酸乙酯和乙醇体积比为1︰2与乙酸乙酯和乙醇体积比为1︰3），在不同体积（5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，30 mL，40 mL和50 mL）的乙酸乙酯︰乙醇=1︰2的溶剂与不同温度（20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃和80 ℃），在200 r/min下振荡20 min，30 min，40 min，60 min，80 min，120 min和150 min下，然后4 800 r/min离心20 min，收集上清液，定容、稀释后480 nm条件下比色测定吸光度。每个样重复测定3次。

1.2.4 响应面试验

通过以上各因素试验，分别将料液比、提取温度与时间对萃取虾青素的综合影响，采用DPS8.1数据

图1 不同溶剂对虾青素提取率的影响

温度对虾青素提取效果的影响如图2所示。试验在温度范围为20 ℃~80 ℃内完成，当温度为40 ℃，虾青素的提取率最高，为38.9%，然后随着温度的升高，虾青素的提取率下降。这种现象归因于两个方面的原因：一是随着温度的升高，虾青素与提取溶剂之间的相互作用随着温度升高而增强；溶剂分子的运动加速导致虾青素的溶解；二是温度过高，虾青素发生了分解，因此提取率下降，所以选择提取温度40 ℃为虾青素的提取温度。

图2 温度对虾青素提取率的影响

2014 年第35卷第 10 期《食品工业》 125 工艺技术

由图3可知，虾青素的提取率随着料液比的增加而提高，在雨生红球藻粉200 mg，加入体积20 mL的乙酸乙酯和乙醇溶剂体积比为1︰2时，虾青素提取率最高，为34.75%，然后随着料液比的增加，虾青素提取率下降。综合考虑，提取虾青素的料液比为1︰100（g/mL）比较合适。

过回归方程各项方差的进一步检验可以得到，失拟检验不显著F1=0.321 1＜F0.05（17，7）=3.49，试验误差小，说明所选模型是适当的。通过多项式回归分析，各变量的回归系数、t值和p值如表4所示。由表4可知，温度（X2）对虾青素提取率（Y）影响显著，而时间（X3）和料液比（X1）对虾青素提取率（Y）不显著，对虾青素提取率影响强弱分别为温度＞料液比＞时间；且料液比（X1）与时间（X3）交互作用及温度（X2）与时间（X3）交互作用显著，料液比（X1）与时间（X3）的平方对虾青素提取率（Y）影响显著。根据t值的大小，可以判断各试验因子对响应值Y的影响依次是X2＞X32＞X12。剔除α=0.10的不显著因子后得到最佳方程式为：Y=29.206 67+3.287 50X2+1.802 92X12+1.827 92X32+1.3X1X2-X2X3。

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果

试验编号X1料液比X2提取温度X3提取时间Y虾青素提取率/%

1

-1-111-1-1110000000

-11-110000-1-111000

0000-11-11-11-11000

28.3532.4027.5036.7531.8533.0034.3032.2026.8029.2535.3033.7530.2028.3129.11

图3 料液比对虾青素提取率的影响

虾青素提取率与提取时间的相关性如图4所示。在时间为60 min时，提取率到达最达值，为35.2%。然后随着提取时间的延长，提取率下降，原因是虾青素不稳定，提取时间过长，使得总虾青素发生了部分分解。

234567101112131415

图4 时间对虾青素提取率的影响

2.2 响应面试验结果与分析

根据单因素试验的结果，以料液比（X1）、温度（X2）和提取时间（X3）为变量，虾青素的提取率（Y）为响应值，进行3因素3水平中心组合试验，响应面试验设计的结果如表2所示。根据多项式回归方程：

Y=b0+∑bixi+∑biixi2+∑bijxixj

i=1

i=1

i=1

m

mi＜j

（1）

按照15个试验结果计算出所拟合的回归方程的各项系数，利用DPS软件得到回归方程为：Y=29.206 67+0.3 75X1+3.287 50X2-0.006 25X3+1.802 92 X12+0.240 42X22+1.827 92X32+1.3 X1X2-0.812 5 X1X3- X2X3。

根据试验结果进行方差分析，由表3可知，拟合的二次多元方程的F值为26.201 3，说明用回归方程描述的因变量与全自变量之间的回归效果显著。通

决定系数R2用来检查模型是否合适，其值为0.979 2，对虾青素提取率来说，意味着97.92%样品变化归因于单变量，总变量中仅有3.01%不能通过模型来说明。以上的数据可以证明所用模型的拟合程度良好，试验的误差小，说明该模型是合适的。

响应面试验的互作效应如图5和图6所示。从图中可以作图可以直观的分析两因子间的互作效应。图2反应了料液比（X1）与温度（X2）互作效应关系，在一定的料液比下，虾青素提取率随着温度的升高而提高，达到一定程度出现小幅回落；随着料液比的增大，提取率也缓慢上升。图4形状呈钟罩型，说明温度和料液比交互作用比较显著，并且温度对提取率影响最大，这与表4的结果一致，交互值中X1X2的p值最小。图5反应的是温度（X2）与时间（X3）交互作用关系，在一定的温度下，随着提取时间的延长，虾青素提取率增大，随后又出现下降的趋势；当温度与时间处于低水平时，虾青素提取率也较低。

126 2014 年第35卷第 10 期《食品工业》工艺技术

表3 响应面模型的方差分析（ANOVA）

变异来源回归残差失拟性检验误差总变异

平方和自由度均方125.779 4913.975 52.666 950.533 40.866 91.800 1128.446 4

3214

0.2 00.900 0

F值F2=26.201 3F1=0.321 1

p值0.001 10.814 7

2.3 提取工艺的优化与验证

依据以上的优化试验，对回归方程方解求解，得到优化条件组合为：料液比为1︰150（g/mL），提取温度50 ℃，提取时间为40 min，在这些条件下，虾青素的提取率为36.21%，与优化方案的理论值40.12%比较接近。

表4 回归方程的变量、系数、t值和p值

变量X1X2X3X12X22X32X1X2X1X3X2X3

回归系数0.3 73.287 5-0.006 21.802 90.240 41.827 91.300 0-0.812 5-1.000 0

标准回归系数

0.160 70.820 4-0.001 60.307 40.041 00.311 60.229 4-0.143 4-0.176 5

t值2.493 112.731 80.024 24.743 50.632 .809 33.560 02.225 02.738 5

p值0.0 90.000 00.981 60.005 10.5 80.004 80.016 20.076 60.040 9

3 结论

响应面试验设计对回归方程的建立与条件优化一种非常有用的方法。以有机溶剂萃取雨生红球藻中的虾青素，采用Box-Benhnken试验设计方法，建立影响虾青素提取率的料液比（X1）、温度（X2）和提取时间（X3）的条件优化模型：Y=29.206 67+0.3 75X1+3.287 50X2-0.006 25X3+1.802 92X12+0.240 42 X22+1.827 92X32+1.3X1X2-0.812 5X1X3-X2X3。

3个因素中对虾青素影响最大的为温度，其次是料液比，最后为时间。优化后的萃取条件： 料液比、提取温度和提取时间分别为1︰150（g/mL），50 ℃和40 min。在此条件下，虾青素提取率为36.21%，与预测值40.12%比较接近，证明优化后的条件是可靠的。

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图5 温度（X2）与料液比（X1）互作效应对虾青素

提取效率的影响

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图6 温度（X2）与时间（X3）互作效应对虾青素提

取效率的影响

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2014 年第35卷第 10 期《食品工业》 127