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(收稿日期=2017-01 -19)
DOI：10.3969/j.issn. 1671 -4695.2017.11.002
文章编号=1671 -4695(2017) 11 - 1044 -04
冷刺激诱导哮喘小鼠支气管上皮细胞炎症反应的研究
刘海沛华丽刘全华潘俊鲍一笑* (上海交通大学医学院附属新华医院儿童吟吸科上海2_2)目的探讨冷刺激对哮喘小鼠支气管上皮细胞炎症反应的影响以及蛋白激酶C(PKC)-核因子-kB (NF-kB)信号转导通道的变化情况。方法原代分离培养哮喘模型小鼠支气管上皮细胞，并将细胞分为对照组（37T：
【摘要】
hThTPCR方法检测三组细胞炎性细胞因子白 细胞介素（IL) - lct、IL - 1|3、IL -4、IL -6、IL -8、IL - 10、IL - 13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM - CSF)及肿瘤坏 死因子（TNF) -a mRNA表达，免疫荧光法检测磷酸化PKC及磷酸化NF - kB抑制因子（IkB)并测定其荧光值以判定 PKC及NF-kB活性。结果各冷刺激后，除IL-la mRNA表达量太低无法进行分析外，其余各基因表达量均显著升 高（P <0.05)。其中IL-lp和GM -CSF表达在冷刺激24 h后增加最为明显，IL -13表达在冷刺激48 h后增加最为
培养）、24 冷刺激组（18：培养）和48 冷刺激组（18：培养），实时荧光定量
明显，而11^-4、11^-6、11^-8、11^-10及1^?-〇1冷刺激24 11和48 11,作用效果基本一致。并且与对照组相比,24 11冷刺 激组和48 冷刺激组的磷酸化
PKC、磷酸化IkB蛋白表达量均明显增加（P <0. 05)。结论冷刺激能够诱导哮喘小鼠 支气管上皮细胞的炎症反应，而PKC-NF-kB可能是这一过程中的重要信号转导途径。
【关键词】小鼠哮喘支气管上皮细胞冷刺激炎症蛋白激酶
h
C核因子-kB
Study on inflammatory response of bronchial epithelial cells induced by cold stimulation in asthmatic mice. LIU Hai - pei, HUA Li, LIU Quan huaet al. Department of Respiration-, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of MedicineShanghai 200092, China.
—, ,
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：8l3〇〇〇2l)
* 通讯作者：鲍一笑，E - mail :drsmilebao@ 163. com
係洙和卖验區摩雇
【Abstract】
4 2017年6
两第
16象
第
11期•
1045 •
Objective To explore 出e effect of cold stimulation on inflammatory response of bronchial epithelial cells in asthmatic mice and the changes in protein kinase C (PKC) - nuclear factor - kB (NF - kB ) signal transduction pathway. Methods The cultured bronchial epithelial cells of asthmatic mice were divided into control group (cultured at 37°€ ) , 24 h cold stimulation group ( cultured at 18) and 48 h cold stimulation group ( cultured at 18°€ ). The expression levels of inflammatory cell factors as interleukin (IL) - la>IL-lp,IL-4,IL-6,IL -8 , IL - 10 , IL - 13 , granulocyte - macrophage colony stimulating factor ( GM - CSF) and tumor necrosis factor (TNF - a ) mRNA were detected by real time quantitative PCR, phosphorylated PKC and phosphorylated NF - kB inhibitor (IkB) were detected by fluoroimmunoassay, and the fluorescent values were detected to determine the activity of PKC and NF - kB. Results After cold stimulation, the expression level of IL - a gene was too low to be analyzed, the expression levels of other genes were significantly increased ( P <0. 05). The expression of IL - 1 p and GM -CSF in 24 h after cold stimulation was significantly increased, the expression level of IL - 13 in 48 h after cold stimulation was significantly increased ,while the expression levels of IL - 4, IL - 6, IL - 8 , IL - 10 and TNF - a in 24 h and 48 h after cold stimulation were basically the same. In comparison with the control group, expression levels of phosphorylated PKC and phosphorylated IkB protein were significantly increased in 24 h and 48 h after cold stimulation ( P < 0. 05). Conclusion Cold stimulation induces the inflammatory response of asthmatic bronchial epithelial cells, and PKC and NF - kB are important signal transduction molecules in signal pathway.
[Keywords] Mice; Asthma ； Bronchial epithelial cell ； Cold stimulation ； Inflammation ； Protein kinase C ； Nuclear factor - kB
支气管哮喘是一种可以被冷空气刺激而诱发加重 的慢性气道炎症性疾病，各种炎症介质在哮喘急性发作 患者体内的浓度明显升高[1]。研究显示，在多种细胞 内，蛋白激酶()可激活核因子-k(-k)，而
采用实时荧光定量方法检测炎性细胞因子白细胞
介素（) -、-4 -6 -8 -10 -13、粒 细胞-巨嗟细胞集落刺激因子 - )及肿瘤坏死
PCR
ILipIL、IL
因子(TNF) - a mRNA表达，免疫荧光法检测磷酸化 CPKCBNFB
活化的NF - KB又可启动多种炎性细胞因子的基因转 PKC及磷酸化NF - KB抑制因子（IkB)以判定PKC及 录，增加其表达[2]。因此，NF - KB可能作为PKC的下 NF-kB活性。游信号分子在支气管哮喘的发生发展中起到一定的作 1.4实时荧光定量PCR检测炎性细胞因子mRNA表
提取细胞总RNA, 用。此外，冷刺激作为引起哮喘急性发作的常见因素， 达使用RNAiso(日本Takara公司）
设 其影响哮喘发生发展的机制尚未明了。在本研究中，我 逆转录为cDNA备用。采用Primer Blast(NCBI网站）计引物并交由捷瑞生物工程公司进行合成。用实时荧
哮喘小鼠支气管上皮细胞炎症反应的影响，探讨冷刺激 光定量 PCR 扩增仪（Biorad CFX96)和 SYBR Premix Ex
Taq™ (日本Takara公司）进行实时定量PCR。反应体 诱发哮喘急性发作的病理过程。
们分离培养哮喘小鼠支气管上皮细胞，并观察冷刺激对
、IL、IL、IL
（GMCSF
II
1材料和方法
1.1实验动物6~8周57
系为20 pi，反应参数为:95°C预变性2 min，进行40个 循环（95°C变性10 s，60°C退火30 s，72°C延伸45 s);从
65
CBL/6小鼠（购自上海西普
尔-必凯实验动物有限公司）30只，雌雄各15只，体质 量均为20 ~25 ，正常饲养一周后建立哮喘小鼠模型。 1.2细胞培养与分组按照以往的研究方法建立哮喘 小鼠模型[2’3]。以〇. 1%卵蛋白氢氧化铝佐剂（上海实
验试剂有限公司）腹腔注射致敏57/6小鼠（上海西
g
°C逐步升温至95°C (每步变化0. 5°C )以进行溶解曲
线分析。样本均设3个平行反应管，定量结果取均值并
用相应内参基因P - actin标化，采用2_AAQ方法分析目 的基因mRNA相对表达量。
1.5
CBL
免疫荧光法检测磷酸化PKC、磷酸化IkB蛋白表
普尔-必凯实验动物有限公司），每周1次，共2次。末 次致敏2周后以1%卵蛋白溶液(美国
Sigma公司）雾化
达按常规流程进行细胞趴片、固定并进行细胞免疫荧 光检测。兔抗磷酸化PKC多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）及兔抗磷酸化
诱喘，每日1次，共7天。分离哮喘模型小鼠的支气管
上皮细胞，经24 贴壁后用兔抗角蛋白 7抗
hCytokeratin体(美国Santa Cruz公司）对该细胞进行鉴定。计数细
IkB多克隆抗体（美国Santa Cruz
。
公司）工作液浓度均为2 pg/ml。用兔IgG代替一抗作 为阴性对照。荧光显微镜下（Olympus 1X51)观察荧光 蛋白表达，并用Image - Pro Plus软件测定其荧光值1.6统计学分析本项研究中的各组数据以均数±标
胞总数及支气管上皮细胞数以计算支气管上皮细胞纯 度。
哮喘小鼠支气管上皮细胞接种于细胞培养皿，加入 支气管上皮细胞培养液（美国公司），置于
ScienCell37°C、5% C02 培养箱（Heal Force HF151)孵育，培养至
30%〜50%密度，将细胞进行如下分组处理。①对照
组:将细胞置于37°培养;②24 冷刺激组:将细胞置 2结果18低温培养箱 -150)培养24 ;③48 冷 2.1小鼠支气管上皮细胞的鉴定分离的小鼠支气管
经染色，荧光显微 刺激组:将细胞置18低温培养箱 - 150 )培 上皮细胞在角蛋白抗体作用后，
°C
养48 。每组各10只。
镜下所有细胞核呈蓝色荧光，胞浆呈红色荧光或无荧
细胞纯度大于90%。见图1。1.3观察指标培养规定时间后收集上述各组细胞，光，
h
C
（ThermoRI°C
h
LSD
验进行两两比较。两组间比较采用两独立样本f检验。 以P <0.05为差异有统计学意义。
DAPI
准差（* ± 〇表示，应用 18. 0统计软件进行分 析。多组间均数比较采用单因素方差分析，并用检
SPSS
h
（ThermoRI
h
•
1046 •
Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol. 16, No. 11 Jun. 2017
2. 2
冷刺激对哮喘小鼠支气管上皮细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响冷刺激后，除IL - lex基因表达量 太低无法进行分析外，其余各基因表达量均显著升高 (P <0.05)0 其中 比-13 fljGM -(1及达作冷刺激24 h和48 h后有统计学差异（P <0. 05)，而： -4、IL-6、広-8、広-10、TNF - a 冷刺激24 h 和48 h,
图i哮喘模型小鼠支气管上皮细胞原代分离及角蛋白抗体鉴定
A:目的蛋白在细胞中的表达;B:经DA®染色后显示出蓝色荧光的 细胞核;C:经DAPI染色后显示出红色荧光的细胞质
表1
作用效果基本^致。见表1。
各组小鼠支气管上皮细胞炎性细胞因子mRSA相对表达量比较（* ± S )
f 3/ P 3值24 h冷刺激组（n二10)48 h冷刺激组:(n = 10)^ 2乂 P 2 值tj/pM
IL-lp3.43 ±0.410.0001/<0.010.95 ±0.044.49 ±0.360.0005/<0.010.0281/<0.05IL-40.0002/<0.010.99 ±0.134.76 ±0.635.01 ±0.500.0005/<0.010.6231/>0.05
5.97 ±0.84IL-61.06 ±0.105.52 ±0.780.0006/<0.010.0006/<0.010.5403/>0.05
5.32 ±0.110.0001/<0.010.0000/<0.01IL-80.89 ±0.104.84 ±0.460.1523/>0.05
IL-100.87 ±0.124.04 ±0.370.0011/<0.010.0001/<0.015.09 ±0.860.1239/>0.05
0.86 ±0.120.0002/<0.010.0001/<0.01IL-132.06 ±0.105.78 ±0.580.0003/<0.01
GM - CSF1.12 ±0.113.09 ±0.120.0000/<0.014.55 ±0.590.0006/<0.010.0137/<0.05
1.14 ±0.143.77 ±0.644.15 ±0.580.0009/<0.010.0023/<0.010.4910/>0.05TNF-a
截i *:/ P i :24 h冷刺激魅与对照组柑比；* P 2 :48 h玲刺激组:与对照组相比；13/ P 3 :24 h冷刺嫌组与48 h冷刺激组相比,,
细胞因子
对照组（n二10)
2.3冷刺激对磷酸化PKC和磷酸化IKB蛋白表达量组的磷酸化PKC、磷酸化IKB蛋白表达量均明显增加，的影响与对照组相比，24 h冷刺激组和48 h冷刺激差异有显著性（Z3 <0.05) 6见表2、图2、图3。
表2
各组小鼠磷酸化PKC和磷酸化IkB蛋白相对表达量比较
指标
磷酸化PKC蛋白表达量磷酸化IkB蛋白表达量
24 h冷刺激组（n二:10) 48h 冷刺激组(n = 10)tx/PM尤2, P 2值^斤s值
1.03 ±0.122.55 ±0.264.83 ±0.570.0203/<0.050.0019/<0.010.0054/<0.01
3.91 ±0.440.98 ±0.116.15 ±0.290.0109/<0.050.0032/<0.010.0076/<0.01
植£, * / P ! :24 h冷刺激组与对照■相比；* 2/P :2 :48 h冷刺激组与對照组相比；f 3/ P 3: :24 h冷刺镦組与48 h冷刺激缀相比,,
对照组(n = 10)
图2冷剌激后，磷酸化PKC蛋白表达 图3冷剌激后,磷酸化IkB蛋白表达
A:目的蛋白在细胞中的表达;B:经DAPI染色后显示出蓝色荧光的细胞核；A:目的蛋白在细胞中的表达;B:经DAPI染色后显示出蓝色荧光的细胞核;
C:经DAPI染色后显示出红色荧光的细胞质
C:经DAH染色后显示出红色荧光的细胞质
3
讨论炎症性疾病M。多种因素可以诱发慢性气道炎症性疾 支气管哮喘(bronchial asthma,BA)简称哮喘，.是由、 病，其中冷空气刺激是引起慢性气道炎症性疾病加童的 多种细胞（如嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T淋 一个重要环境因素[5]。此类患者在天气转凉或轻微受 巴细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性
凉时急发加重，而细菌感染、炎性因子浸润以及黏液分
<14珠
和实验
2017 + 6 |
第
16 |
第
11期•
1047 •
泌等均可能导致该病呈现更复杂的病理改变[M]。从某 种意义上而言，冷空气刺激在一定程度上对于的触
BA
用途径中重要的信号转导分子。在临床应用上，对于患 有哮喘的病患应当尽量减少冷刺激，从而缓解患者的生
理压力;并且推测和 - 是冷刺激导致炎症反
发或急性加重起着“扳机点”的作用。
PKCNFKB
NHBEniLlaILipIL
4，IL - 6，IL - 8，IL - 13，GM - CSF 及 TNF - a)转录增
(
管上皮细胞并且模拟冷刺激诱发哮喘急性发作的体内
有研究显示冷空气可促使正常人支气管上皮细胞
)中多种炎性细胞因子〇-，-，-
应的重要信号转导分子，因此之后的研究可以从这方面 入手，研究应用靶蛋白治疗慢性气道炎症疾病防控。由 于该研究限于体外细胞水平，无法完全模拟冷刺激诱发 哮喘急性发作的体内环境，因此，尚需建立完善相关的 动物模型以进一步探讨冷刺激诱发哮喘的发病机制。参考文献
加[8]。在本研究中，我们分离、培养原代哮喘小鼠支气 环境，探讨冷刺激在诱发气道炎症过程中的作用及其分 子调控机制。本研究结果显示，原代培养的哮喘小鼠支
[1 ] Polonikov AV, Ivanov VP, Bogomazov AD, et al. Genetic and bio
气管上皮细胞经冷刺激（18°C)24 h和48 h后，除IL
-
la基因表达量太低，无法进行分析，其余各炎性细胞因 子 CSFIL-ip、IL -4、IL -6、IL -8、IL -10、IL -1ILa3、GM - 及TNF - mRNA表达水平较对照组明显增高，其 中IL-ip、-13和CSF2表达在冷刺激24 h和48 h 后有统计学差异（P <〇.〇5)。而针对冷刺激时间长短 不同，细胞中基因表达也存在差异，冷刺激24 h和48 h 后细胞中基因IL -1 p、IL - 13、GM - CSF的mRNA相对
表达量出现显著差异，其余基因差异无统计学差异。这 一现象说明了冷刺激可以导致支气管上皮细胞中多种 炎症因子的表达增加，并且随着冷刺激时间增长，炎症 因子转录增加越多。
多项研究表明，NF-
KB在变态反应性中发挥重要
作用，在哮喘的发病机制中，NF - KB主要定位于气道上
皮细胞和肺泡巨嗟细胞内，许多哮喘患者诱导痰中巨嗟 细胞和支气管黏膜上皮活检均显示NF - KB
异常激
活[9>1°]。此外
，NF - KB还可促进淋巴细胞增殖和抑制
其凋亡，这可能是促进哮喘炎症反应和气道高反应性的 机制之一，由此可见，NF - KB与哮喘的发病密切相 关[11]。
PKC是一种多肽物质，在细胞中的存在形式大
多为无活性，经过细胞信号分子激活后可对细胞增殖分 化产生影响。有报道认为PKC
对转录因子NF - B
的活
化起到了积极作用，
BPKC通过激活应答生长因子来激活 核因子，导致酶的活性增高，介导IB激酶完成活化转 录因子NF-B的路径[13]。在本项研究中，我们发现冷 刺激下哮喘小鼠支气管上皮细胞内磷酸化PKC及磷酸 化IkB蛋白含量（即PKC活性及NF - KB活性）明显增 高，这提示PKC - NF - KB信号转导通道可能参与了炎
症反应过程。该结果也与杜春玲等人的研究结果一 致[12]。4
结论
综上所述，本研究证实冷刺激诱导哮喘小鼠支气管 上皮细胞炎性细胞因子的合成，PKC和NF - KB
是该作
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(收稿日期:2017 -01 -05)
N
学
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