核酸-蛋白质互作

核酸－蛋⽩质互作的⽣物化学研究⽅法张⾦璧, 潘增祥, 林飞, 马雪⼭, 刘红林南京农业⼤学动物科技学院, 南京210095

摘要:研究核酸－蛋⽩质的互作是揭⽰⽣命活动机理的基础, ⽂章简要综述了⽤于研究核酸－蛋⽩质互作的各种⽣物化学⽅法。从体内、体外两个研究⾓度, 针对核酸、蛋⽩以及复合物3个研究⽔平, 概述了硝化纤维膜过滤实验、⾜迹法、EMSA、Southwestern杂交等经

典分析⽅法的原理、发展和运⽤。还着重介绍了最近在表观遗传学领域中⼴泛运⽤的nChIP、xChIP等基本染⾊质免疫沉淀(ChIP)技术及其衍⽣出的ChIP-on-chip等⽅法。关键词: 核酸; 蛋⽩质; 互作; ⾜迹; 染⾊质免疫沉淀

Biochemical methods for the analysis of DNA-protein interactionsZHANG Jin-Bi, PAN Zeng-Xiang, LIN Fei, MA Xue-Shan, LIU Hong-Lin

College of animal science and technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract: Investigation of DNA-protein interactions is fundamental to understand the mechanism underlying a variety of lifeprocesses. In this article, various types of biochemical methods in

DNA-protein interaction study in vivo and in vitro at the level of DNA, protein, and the complex, respectively were brieflyreviewed. Traditional assays including Nitrocellulose filter-binding assay, Footprinting, EMSA, and Southwestern blottingwere summarized. In addition, chromatin immunoprecipitation techniques including nChIP, xChIP, and ChIP-on-chip, whichwere widely used

in epigenetics, were particularly introduced.

Keywords: nucleic acid; protein; interaction; footprinting; chromatin immunoprecipitation (ChIP) 核酸－蛋⽩的互作在⽣命活动中发挥着⼴泛⽽重要的作⽤, ⼆者的协作是各种

⽣命现象的基础。将细胞或细胞器中的蛋⽩质、核酸等⽣物⼤分⼦的相互作⽤联系起来, 是综合研究⼀个完整的⽣物学途径的核⼼内容[1]。近半个世纪以来, 研究者们在核酸－蛋⽩质复合物的构成和分解过程中进⾏了⼤量探索, 发展了⼀系列研究其互作关系的⽅法技术, 其中, ⽣物化学相关⽅法⼀直是重点与主流。

⽣物化学法主要利⽤酶或其他化学制剂, 通过切割、修饰等作⽤来分析或分辨存在相互作⽤的核酸和蛋⽩复合物, 研究其间潜在或实际的结合能⼒和结合⽅式。其中DNaseⅠ、ExoⅢ⾜迹法以及更加精练的⾜迹技术, 如羟基⾃由基⾜迹分析、保护/⼲扰实验等, 在鉴别潜在的DNA靶点的基础上可进⼀步⽤于研究DNA-蛋⽩复合物中的DNA构成; 消化纤维膜过滤法、凝胶阻滞分析以及Southwestern印迹等能⽤作结合位点确定后相关蛋⽩的分离分析; 随着表观遗传学的兴起, 建⽴在DNA-蛋⽩交联基础上的染⾊质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)技术迅速发展起来, 成为探索复杂的DNA-蛋⽩复合物结合情况的重要⼿段,被⼴泛运⽤于转录复合体和组蛋⽩修饰的研究。本⽂就相关⽅法的原理、应⽤及发展情况, 从体内、体外两个⽅⾯进⾏综述。1体外的⽣化研究⽅法

在对于蛋⽩质－核酸互作的多数研究, 尤其是早期研究中, ⽬的蛋⽩和⽬的核酸被分别提取出来, 在⼈⼯条件下进⾏孵育结合, 进⾏相关研究。虽然实际上在⽣物体中, ⼆者有可能因为空间、电荷等各种关系⽆法接近⽽产⽣作⽤, 但体外⽅法有效地体现了核酸和蛋⽩质能够发⽣互作的潜⼒, 为核酸－蛋⽩质研究所⼴泛运⽤。1.1 硝化纤维膜过滤实验

膜过滤⽅法在核酸－蛋⽩质复合物研究中渊源已久, 最初⽤于RNA－蛋⽩质的互作研究[2], 后由Jones和Berg[3]于1966年⾸次将其⽤于DNA－蛋⽩质的研究中。其原理是蛋⽩与硝化纤维膜(Nitrocellulose filter, NCF)结合, 但DNA不与其结合。将标记过的DNA与蛋⽩质共同孵育, ⽤NCF过滤混合物, 则DNA能够通过NCF, ⽽DNA- protein 复合物留在NCF上。随后⼲燥NCF, 通过标记物定量分析留在滤膜上的复合物, 即可判断⼆者的结合程度。

NC膜过滤的⽅法虽然在当前的研究中逐渐减少, 但其操作快速、简单, 能够定量地研究蛋⽩质与DNA相互作⽤, 仍在分析较多个核酸－蛋⽩质的互作关系中有⼀定⽤途。Tran等[4]在蛋⽩互作研究中, ⽤膜过滤法确定促旋酶的DNA结合特性, Haque等[5]在研究线粒体翻译起始因⼦与核糖体的互作关系

时, ⽤此⽅法分析起始复合物中RNA与核糖体蛋⽩的结合量变化情况; Posner等[6]结合芯⽚作⽤原理, ⽤滤膜板⼀次性检验384

个G 蛋⽩联合受体的可能结合部位。1.2⾜迹法

⾜迹法最⼤的特点在于能确定蛋⽩结合DNA的⽚段长度, 其基本原理与DNA化学测序法相似, ⾸先将待测双链DNA⽚段进⾏标记, 然后加⼊适当浓度的探针对DNA进⾏消化剪切, 由于剪切具有随机性, 在反应完全时可将DNA切成单核苷酸。若控制探针浓度, 将DNA部分消化, 就可以形成⼀个单核苷酸、⼆核苷酸、三核苷酸……n核苷酸的混合物[7]。经变性后电泳分离, 放射⾃显影, 即可形成以相差⼀个核苷酸为梯度的DNA条带。但当结合上蛋⽩时, 相应的DNA序列不会受探针的攻击, 因⽽在放射⾃显影图谱上DNA梯度条带在相应DNA结合蛋⽩的结合区域中断, 形成⼀空⽩区域, 恰似蛋⽩质在DNA上留下的⾜迹, 因⽽被形象地称作⾜迹法。具体原理见图1。

随着可选⽤的探针逐渐丰富, ⾜迹法的具体研究⽅法和功能也丰富起来, 针对不同⽤途选取不同的探针, 在解决多种实际问题中起到了很⼤作⽤。⽤于互作分析的探针主要有两种: ⽣物酶探针和化学探针, 以下分别进⾏介绍。1.2.1 酶⾜迹法

⽣物酶探针特异性好, ⼀般不会与要研究的结合蛋⽩作⽤, 不会扰乱DNA与蛋⽩质的互作。因此在脆弱的DNA－蛋⽩质复合体中, 酶探针更受欢迎[8]。DNaseⅠ和exonucleaseⅢ是两种最主要的⽣物酶探针, 在定位与蛋⽩质结合的DNA序列上有较⼤优势。

1.2.1.1 DNaseI⾜迹

DNaseⅠ是直径约40?的蛋⽩, 结合在DNA⼩沟, 独⽴地切割两条链的磷酸⾻架[9]。由于其体积较⼤, 切割作⽤更容易受空间位阻作⽤的影响, 不能切割到有蛋⽩覆盖的区域及周边的DNA, 因此是⾜迹法中确定DNA－蛋⽩结合与否的理想⽅法之⼀, 可以确定结合在蛋⽩上的DNA的⽚段长度, 但不能给出具体核酸序列。

DNaseⅠ⾜迹法由Galas和Schmitz[7]于1978年⾸次运⽤于DNA序列特异性结合蛋⽩的研究中。通常是将DNA单链末端标记, 然后与结合蛋⽩反应, 复合物⽤DNaseⅠ部分消化。结合蛋⽩的区域受到蛋⽩保护, 免受DNaseⅠ攻击, ⽽产物由于分⼦量的差异, 经电泳和放射⾃显影即可得到⼀系列条带, 与对照消化产物的连续条带相⽐, 其中空缺部分即为蛋⽩的结合区域。

图1 ⾜迹法原理

通过同⼀DNA⽚段与多个蛋⽩的⾜迹分析, 可推断这些蛋⽩的结合域是否有交叠或相互分开, 从⽽推测这些蛋⽩之间的协作对基因的调节, 如Makarewicz等[10]⽤单体PhoP进⾏DNaseⅠ⾜纹法分析得出, PhoP_P⼆聚体在phy C启动⼦上有两个结合区域,在启动⼦-35位的结合促进启动⼦活性, ⽽在-10的结合抑制其活性; Matta等[11]在拮抗酶Ato C和细菌元件的互作研究中, ⽤DNaseⅠ⾜迹法检测Ato C的结合位点, 得出其在两个20 bp的位置结合, 序列分析得出这两个位置正好构成与转录起始位点相关的回⽂序列。DNaseⅠ⾜迹法在确定单⼀转录因⼦结合区的研究中应⽤也很⼴泛。近期应⽤此法的⼀个典型例⼦是

Connaghan-Jones等[12]在研究孕酮受体与⼩⿏乳腺肿瘤病毒启动⼦的互作时, 采⽤DNaseⅠ⾜迹法检测出PR-a在启动⼦上的5个特异结合区域。

当然, DNaseⅠ法亦有其缺点。由于⼀些结合蛋⽩也会与其发⽣作⽤, 导致⼀些DNaseⅠ超敏感位点的存在。另外DNaseⅠ对DNA的切割有位点偏好性, 因此得出的电泳梯度条带是不均匀的, ⽽且实验中底物需要量⼤, 不能⾃动区别开DNA－蛋⽩质复合体上的多个组分。这些不⾜使DNaseⅠ技术具有⼀定局限性。1.2.1.2 外切酶Ⅲ⾜迹法

外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ, ExoⅢ)加⼯过程独特, 使其在研究序列特异性结合蛋⽩的⼯作中成为⼀种常⽤的探针, 适⽤于蛋⽩结合位置DNA序列的分析。

ExoⅢ是单体酶, 分⼦量⼩(28 000 kDa), 具有3'→5'外切酶活性、RNaseH 活性、3′磷酸酶活性和AP核酸内切酶活性[13]。ExoⅢ⾜迹法运⽤了其3'→5'外切酶活性[14], 当ExoⅢ切割双链DNA时, 有蛋⽩结合的位置被保留下来, 产⽣的两条单链DNA⽚段经过变性凝胶电泳分析, 放射⾃显影检测即可得到结合⽚段⼤⼩。⼀般来说, ExoⅢ⾜迹的切割⽚段要⽐DNaseⅠ略⼩⼀些, 所有的未被结合的DNA都被完全消化, 这是ExoⅢ的优势所在, 不存在⾃由DNA产⽣的背景问题。不过使⽤ExoⅢ探针的先决条件是, 蛋⽩和DNA互作的半衰期不能少于Exo III作⽤所需要的时间[8]。

ExoⅢ⾜迹法最早由Shalloway等[14]采⽤, 通过此⽅法, 他们⽤SV40 T抗体找出了SV40 DNA复制起始位点结合区域。在新近的研究中仍受欢迎, 如

Wu等[15]在对铂类抗癌药物的研究中⽤ExoⅢ⾜迹法验证了铂类药物与核苷酸序列的结合情况, 在药物交联位置酶切明显受阻,由此证实了铂类抗癌药在治疗中的可⾏性。Chen等[16]将荧光染⾊技术和ExoⅢ⾜迹结合, 由于酶切DNA时激发了结合在探针上的SYBR Green I的释放, 荧光强度在酶切和⾮酶切位点显⽰出强弱差别并能被⽅便地检测出来, 这种改进使得ExoⅢ⾜迹法更快速敏感⽽且经济。Yang等[17]发现ExoⅢ并⾮只切割双链核苷酸, 将其与a-thiotriphosphate以及聚合酶结合使⽤, 可以分析⽣物合成过程中多个⼤分⼦的协作⾏为, 对ExoⅢ的应⽤进⾏了新的探索和拓展。

1.2.2 化学⾜迹法

理论上说, 能切断DNA⾻架的化学试剂同样能作为探针, 与酶探针相似, 当DNA与蛋⽩质结合时, 探针⽆法到达结合了蛋⽩的位点, 因此, 在化学探针作⽤后再进⾏电泳, 这些没有被切断的位置将形成空⽩条带。羟⾃由基⾜纹法(Hydroxyl radicalfootprinting)即是其中应⽤较⼴泛的代表[18]。

羟游离基⾜纹法是⾼分辨率的描绘DNA－蛋⽩质互作关系的⽅法。它利⽤芬顿反应产⽣的⾃由羟基来攻击核糖⾻架, 打开DNA主链, 从⽽获得⾜纹, 由于羟基作⽤点在沿着DNA分⼦表⾯排列的脱氧核糖上, 因此完全不受碱基的序列及种类的影响[19], 当DNA主链的脱氧核糖被蛋⽩质覆盖后, ⾃由羟基⽆法接近, 于是其产物在测序凝胶中出现若⼲区带强度减弱的区域, 此即DNA主链与蛋⽩质的作⽤点。与DNaseⅠ和ExoⅢ⾜迹法不同, 羟游离基⾜纹法形成的⾜迹更⼩, 羟⾃由基只有⽔分⼦⼤⼩, 不受空间位阻约束, ⽽且切割均匀, 分辨率⾼, DNA分⼦主链的全部位置可从⾜纹图⼀览⽆遗, 展现出更加详细的信息。⽽且裂解效率⾼, 化学探针易于制备, 操作简便。此法⾸先由Tullius等[20]进⾏了总结, 在新近研究中, Sanders等[21]⽤Hydroxyl-radical⾜迹法成功分析了BPV initiator protein E1在原核⽣物体中对DNA的结合情况。

羟游离基⾜纹法的主要的局限在于⾃由羟基也攻击蛋⽩, 反应时间较长容易导致⼀些敏感蛋⽩的降解, 扰乱原有的互作状态。对此, Shcherbakova等[22]发明了⼀种“快速芬顿(Fast fenten)”的⽅法, 在毫秒级的分辨率下研究⼤分⼦折叠, 互作和配合, 在DNA、RNA和蛋⽩的瞬时作⽤上都可运⽤, 为解决这⼀问题提供了新思路。1.2.3 保护实验/⼲扰实验

此类⽅法先⽤化学试剂修饰DNA, 再结合⾜迹法, 可以得到碱基特异性结合位点相关的详细信息。最常⽤的试剂有硫酸⼆甲酯(Dimethylsulphate, DMS, 与嘌呤尤其是G作⽤)和⼄基亚硝基脲(Ethylnitrosourea, 与磷酸⼆酯键⾻架作⽤)。由试剂对DNA修饰和蛋⽩结合的时间不同分为两种, ⼀般来说先结合蛋⽩再修饰, 称为保护实验; 先修饰再与蛋⽩结合, 称为⼲扰实验[23], 也有名称混⽤的情况。

1.2.3.1 甲基化(DMS)保护/⼲扰实验

甲基化保护实验是研究蛋⽩与DNA双螺旋⼤沟中的鸟嘌呤残基互作中最常⽤的⽅法, 也⽤于研究与⼩沟中腺嘌呤的互作。DMS能与嘌呤快速反应, ⽣成N7-甲基鸟嘌呤或N3-甲基腺嘌呤。鸟嘌呤的N7位于双螺旋的⼤沟中, 因此保护实验⼀般可以揭⽰蛋⽩质侧链和特异碱基在⼤沟⾥的结合, ⽽腺嘌呤的N3位于双螺旋⼩沟内, 所以也可以指⽰出通过⼩沟与DNA结合的蛋⽩[24]。本⽅法的基本步骤与DNaseⅠ⾜迹法相似, 结果也类似, 但主要显⽰出了作⽤在G残基上的蛋⽩。在保护实验中, 蛋⽩质先与标记过的DNA⽚段结合, 然后⽤DMS处理, DMS会使⼤沟中所有没有蛋⽩保护的鸟嘌呤(以及⼩沟中没有蛋⽩保护的腺嘌呤)甲基化,随后在六氢吡啶(Piperidine)作⽤下被剪切。最后将所得DNA⽚段⽤电泳分离, 放射⾃显影, 与先前没有与蛋⽩孵育的DNA 剪切条带进⾏对⽐, 即可显⽰出空⽩的蛋⽩结合区域。此法在特异性结合的蛋⽩研究中较常⽤, 如Flanigan等[15]采⽤DMS保护实验分析偏好在嘌呤碱基上结合的Gifsy-1 Xis蛋⽩和Gifsy-1 attP序列的互作。

虽然保护技术在许多蛋⽩上运⽤顺利, 但DMS会直接作⽤于某些蛋⽩, 可能破坏其与DNA的结合[26]。⽽且, 为了观察到⾜纹,保护技术需要核酸与蛋⽩质极紧密的结合[27], 这些局限性催⽣了第⼆种技术——甲基化⼲扰实验(Methylation interferenceassay)的出现。即先⽤DMS处理靶DNA, 使平均每条链上只有⼀个G残基被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋⽩的细胞提取物共同孵育, 结合位点以及附近的DNA的修饰会阻⽌蛋⽩的结合。随后进⾏凝胶阻滞试验, 分离各种DNA条带, 并⽤六氢吡啶切割甲基化的残基, 再与未结合蛋⽩的对照⼀⼀对应进⾏电泳。如果因某个G残基的甲基

化作⽤⽽阻⽌了蛋⽩质与DNA的结合, 那么六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作⽤就只能在没有蛋⽩质结合的DNA中观察到。实验表明, 这是识别蛋⽩质与特异碱基结合的分辨率较⾼的⼀种⽅法[28]。1.2.3.2 ⼄基化⼲涉实验

原则上, 每⼀种化学探针试剂都可以⽤保护或者⼲涉(预修饰)的⽅式进⾏实验, 但实际并⾮如此。甲基化实验⼀般在DNA结合蛋⽩质后再进⾏甲基化修饰, ⽽⼄基化实验则⼀般先⽤⼄基亚硝基脲(Ethylnitrosourea)修饰DNA, 再与蛋⽩结合, 修饰同样会改变蛋⽩的结合程度。具体⽅法与甲基化⼲扰实验相似, 但由于⼄基化修饰作⽤于磷酸⾻架, 相对独⽴, 不受碱基差异的影响, 因此⼄基化⼲扰实验是少数⼏种不受碱基特异性⼲扰的研究⽅法之⼀。另外, ⼄基化⼲涉可以精确地鉴别DNA磷酸⾻架和蛋⽩接触的区域, Zhang等[29]运⽤此⽅法精确定位了Pura蛋⽩激活基因转录是通过和PDGF-A基因启动⼦中富含G的单链区域结合来实现的。

化学⾜迹的⽅法也被统称为⼲扰技术或体内⾜迹法, 其共同的优势在于可以研究蛋⽩质－核酸复合体形成的分⼦细节, ⽽且在只有少量蛋⽩粗提物的情况下也可以进⾏分析[30]。所以, 其仍然是⽬前较为⼴泛应⽤的技术⽅法。1.3结合蛋⽩的定量分析法

以上介绍的多种⾜迹⽅法都可以给出核酸－蛋⽩复合体中核酸的长度或序列信息, 然⽽对于复合物中的蛋⽩组分的分析还需要结合其他的分析⽅法, 才能对核酸和蛋⽩质综合分析, 描述其全⾯的互作情况, 其中最为典型的⽅法是EMSA和Southwestern 杂交。

1.3.1 电泳迁移率变动实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

电泳迁移率变动实验⼜称为凝胶阻滞实验(Gel retardation assay)或凝胶移率变动实验(Gel mobility shift),是⼀种简单、快速和灵敏的⽤于体外检测蛋⽩粗提取物中特异性DNA结合蛋⽩的技术。

EMSA的原理是DNA⽚段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有⼀定迁移率, ⽽蛋⽩质结合后, 由于复合物在体积, 形状, 电荷以及结合位置的不同, 迁移率降低[27]。传统⽅法⽤放射性标记的DNA探针(20~70 bp)与细胞提取物共孵育, 电

泳后经放射⾃显影, 即可把与蛋⽩质结合的探针和⾃由DNA探针从电泳胶上分开。Fried等[31]为我们提供了⼤量早期的EMSA理论和实践的信息, Molloy 等[32]进⼀步阐述了较新的具体⽅法和步骤。

EMSA操作过程简单、快速, 灵敏度⾼(10-18mol DNA[33]), 可⽤于测定DNA－蛋⽩的结合参数, 从⽽⽐较⼀个蛋⽩对⼏个相关DNA位点或者⼏个蛋⽩对同⼀位点的亲和⼒[34]。Zellner等[35]⽤EMSA法检测⿏科动物的pre-RC 蛋⽩与DNA的结合情况, ⽐较发现蛋⽩具有ATP依赖和位点特异性装配的特性。Panno等[36]将EMSA和ChIP平⾏使⽤, 从⽽确定了转录因⼦Sp1基因位点的12个序列参与了雌激素E2诱导的胰岛素受体底物IRS-1表达上调。

随着标记技术的发展, 地⾼⾟等⾮放射性标记的采⽤, 避免了32P等标记探针有接触危险性且不容易定量分析的缺点。⽽且在此基础上发展起来的⽑细管凝胶阻滞电泳技术, 结合了⽑细管电泳的优势, 不需要使⽤放射性同位素, 样品⽤量少, 分辨率⾼, 解决了胚胎⼯程等研究中细胞数量的难题, 进⼀步完善了凝胶阻滞电泳的⽅法[37]。1.3.2 Southwestern杂交

DNA－蛋⽩质印迹杂交, 即Southwestern印迹杂交(Southwestern Blot), ⾃1980年Bowen等[38]创⽴以来, 已⼴泛应⽤于分⼦遗传学、分⼦⽣物学的诸多领域。将核蛋⽩粗提物进⾏SDS－PAGE电泳分析, 转膜后与同位素标记的特异DNA序列探针结合,位点特异性DNA结合蛋⽩借助于氢键、离⼦键和疏⽔键结合DNA探针, 从⽽可通过放射⾃显影对DNA结合蛋⽩进⾏定性、定量分析。最近, Harada1等[39]⽤包含CUX1的双链核苷酸探针进⾏SW杂交, 分析p110 CUX1蛋⽩在DNA复制相关蛋⽩的编码基因中的活化作⽤。

与前述⽅法不同的是, SW⽅法可以根据与标准分⼦量⼤⼩的蛋⽩电泳谱相⽐较, 确定结合蛋⽩的分⼦量。如Chen等[40]为了描述JWA (-107/-28)启动⼦区的结合因⼦, 采⽤SW杂交确定参与核酸－蛋⽩质互作的分⼦, 将anti-CBF/NF-Y、anti-NFI、anti-CEBP, 以及anti-GATA-1抗体分别与同⼀张膜孵育后, 发现只有anti-NFI显⽰有47 kDa的蛋⽩结合作⽤。另外, 将SW和DNaseⅠ或其他⾜迹法结合使⽤可以达到同时检测结合蛋⽩⼤⼩和绘制其同源结合域的双重功效[41]。

SW技术⼀定程度上要求经过SDS－PAGE电泳后的蛋⽩复性, 不同蛋⽩的复性难易程度存在差别, 那些较难复性的蛋⽩附着在膜上后将丧失结合DNA的能⼒。⽽且, 那些需要⼏个亚基或辅因⼦共同作⽤才有结合能⼒的蛋⽩也难以通过这种⽅法检测到。2 体内研究⽅法

染⾊质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)是体内研究蛋⽩质－DNA互作强有⼒的⽅法, 所谓体内(in vivo)⽅法, 是直接将完整的细胞进⾏交联处理, 保持其内核酸和蛋⽩质的结合情况, 之后再对核酸和结合蛋⽩做进⼀步分析。此⽅法不需要分别提取核酸或蛋⽩, 在天然的染⾊质环境下进⾏, 基本保持了⼆者在细胞内的真实结合状态。

ChIP⽅法最早⼴泛运⽤于酵母基因组的研究中[42]。在随后的⼗⼏年⾥, ChIP⽅法经过了研究者们不断的摸索和改进, 迅速发展。随着表观遗传学的兴起和发展, ChIP在染⾊体重塑的研究中崭露头⾓, 被运⽤于染⾊质相关的蛋⽩, 如组蛋⽩及其变异体,特定DNA结构所结合的转录因⼦等研究中。ChIP 的基本操作由对染⾊质的处理⽅法不同分为⾮变性和变性两种, 另外还根据不同实验需要产⽣了多种各具特⾊的⽅法, 如Re-ChIP、ChIP Chop等。⼀般进⾏完ChIP后直接⽤qPCR对DNA进⾏分析, ⽽近年来ChIP与芯⽚技术结合, 展现出更⼴泛的⽤途。2.1 ⾮变性染⾊质免疫沉淀(nChIP)

顾名思义, nChIP采⽤未变性的染⾊质进⾏实验, ⽤微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease)来消化细胞核, 使染⾊质消化成碎⽚,随后⽤对应的抗体将结合有蛋⽩质的染⾊质⽚段选择性地免疫沉淀下来, 再运⽤杂交或PCR ⽅法进⾏DNA序列信息的分析。这个⽅法来源于Dorbic和Wittig[43,44]的技术, O’Neill等[45]在实验室⼯作经验的基础上对此⽅法进⾏了总结和步骤的规范化。nChIP⼀般⽤于具有DNA⾼亲和⼒的组蛋⽩及其变异体的研究中[46,47], 对于核⼼组蛋⽩修饰, 如甲基化、⼄酰化的分析最为合适。Bruce等[48]采⽤nChIP检测了超⼄酰化组蛋⽩变异体H2A.Z与看家基因和组织特异基因在基因转录活化和⾮活化时的结合情况。Huang等[49]在⽩⾎病病理研究中⽤nChIP

检测了GAB Aergic基因启动⼦上的组蛋⽩甲基化情况。在⼀些实验中也有⽤超声波破碎仪代替微球菌核酸酶来破碎染⾊体, 如Roca等[50]对造⾻细胞转录因⼦及其结合位点的研究中的做法, 他们同时也提出了nChIP的⽅法同样适⽤于Dlx蛋⽩和Sin3A等与DNA⾼亲和⼒结合的⾮组蛋⽩。考虑到⼀些转录因⼦与DNA的结合造成空间位阻, 会导致nChIP得到的组蛋⽩结合量偏少,Brand等在染⾊质破碎后⽤羟基磷灰⽯(Hydroxyapatite, HAP)纯化核⼩体, 先去除其他蛋⽩再进⾏免疫沉淀, 提⾼了nChIP的精确性[51]。为了突破底物量的(⼀般需要106~107以上数量级的细胞), O’Neill等[52]还在对⼩⿏胚胎的研究中采⽤了果蝇细胞作为载体, “稀释”⼩⿏细胞, 仅⽤50~100个细胞成功进⾏了nChIP, 并命名为“carrier”ChIP(CChIP), 使ChIP技术的发展迈进了⼀⼤步。2007和2008年, Dahl等[53, ]先后提出了针对少量细胞操作的Q2ChIP 和进⼀步改进后的µChIP的实验⽅法。nChIP在分析核酸－蛋⽩质互作中具有明显的优势, ⾸先, 微球菌核酸酶消化后的染⾊质约为1~5个核⼩体⼤⼩, 可以通过蔗糖梯度离⼼来分离出单个核⼩体核⼩体, 选⽤单核⼩体作为实验⽤的染⾊质, 可以实现特定位点DNA或者特定为点上的蛋⽩质在核

⼩体⽔平上的定位, ⽐变性ChIP更为精确。同时, 没有交联剂的处理, 降低了抗原被削弱和修饰的可能。但nChIP⽅法难以检测到与核酸结合较弱的蛋⽩, 如转录因⼦等。2.2变性(交联)染⾊质免疫沉淀(xChIP)

由于可以在⼤量与DNA联系不太紧密的染⾊质结合因⼦的研究中使⽤, xChIP⽐nChIP的应⽤更加⼴泛。其⽅法是先将染⾊质进⾏变性处理, ⼀般采⽤向细胞中加⼊甲醛[55,56], 或者将细胞暴露在紫外线下的⽅法。使DNA和蛋⽩质发⽣交联, 接着⽤超声波将这些染⾊质切割成⼩⽚段, ⽤特异性蛋⽩质抗体来选择性地免疫沉淀蛋⽩质－DNA复合物。最后逆转交联, 进⼀步分析沉淀下来的DNA。具体流理见图2。

图2变性染⾊质免疫沉淀流理

xChIP适⽤于分析与DNA结合能⼒较弱的蛋⽩(连接组蛋⽩和⼤多数⾮组蛋⽩), ⼀个典型的例⼦是Alcorlo等[57]⽤xChIP检测抗菌素GA-1蛋⽩与DNA 的结合情况。由于xChIP与nChIP分别在⾮组蛋⽩和组蛋⽩的研究⽅⾯具有优势, 形成互补, 可根据实际实验的需要灵活选择。Han等[58]在对CTCF的研究中分别采⽤N-ChIP和X-ChIP分析组蛋⽩共价修饰情况并检测macroH2A1组蛋⽩变异体; Mann等[59]在其研究中也同时采⽤两种ChIP⽅法, 其⽬的是验证和确定抑制蛋⽩IχBα和氧化物酶体增⽣活化受体γ(PPARγ)启动⼦上蛋⽩的结合。

甲醛是xChIP中最为常⽤的交联剂, 在其作⽤下, DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋⽩质上的a氨基及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、⾊氨酸的侧链氨基会与其他DNA或蛋⽩质上的氨基或亚氨基交联在⼀起, 在⼏分钟内形成⽣物复合体。其优势在于, 甲醛并不作⽤于游离的双链DNA, 从⽽避免了DNA损伤, 另外, 醛交联反应是完全可逆的, 便于在后续步骤中分别对DNA和蛋⽩质进⾏分析。值得注意的是, 交联过程中, ⼀些抗原决定基可能发⽣改变或闭塞, 某些抗原本⾝难以⽤xChIP⽅法进⾏共沉淀。另外, 由于不能预测有多少抗原以及多少域点能真正与DNA结合, 也存在某⼀位点之间本⾝存在的结合难易程度不同, 因此X-ChIP⽆法对蛋⽩定量[60]。

nChIP和xChIP的⽅法各有其优势和局限, 总的来说可概括如表1。表1nChIP和xChIP的差别nChIP xChIP

交联处理不⽤交联剂或短时

间交联需要甲醛或紫外线等处理10 min以上染⾊质破碎

⼀般采⽤微球菌酶⼀般采⽤超声波破碎仪研究对象⾼亲和⼒蛋⽩(组蛋⽩

及其变异体等) 低亲和⼒蛋⽩(连接组蛋⽩、转录因⼦等)DNA序列分析易(酶切位点固定)难(破碎的⽚段长度不⼀)蛋⽩定量易难

精确度单核⼩体⽔平染⾊质⽔平沉淀效率

较⾼较低(受抗原决定基影响)in vivo程度较低(过程中核⼩体

可能出现重序) 较⾼(核⼩体重序的可能性最低)2.3 Re-ChIP

Re-ChIP法对同⼀DNA底物, 运⽤两种不同的抗体, 相继进⾏了两次免疫共沉淀, 可以确定两种抗原, 即两种结合蛋⽩在同⼀染

⾊质⽚段上的结合。这种⽅法为DNA结合的蛋⽩复合体的研究提供了新的思路, 让我们能更清晰地描绘蛋⽩的结合次序和相互协作关系。

Re-ChIP法在DNA结合的多蛋⽩复合物, 尤其是转录复合体的分析研究中得到了充分运⽤, ⼀般将ChIP和Re-ChIP连续使⽤, 分别⽤两种抗体与相同DNA底物进⾏沉淀。在启动⼦结合因⼦的研究中, Gaughan等[61]运⽤Re-ChIP ⽅法, 确定PSA基因启动⼦上结合的蛋⽩多聚体中包含AR和HDAC1。Wissmann等[62]先后⽤雄激素受体抗体和JMJD2C抗体进⾏ChIP, 证明了雄激素受体和JMJ D2C都在PSA启动⼦上结合形成蛋⽩复合体。Sayeed等[63]分别⽤ERa和p53的抗体进⾏免疫共沉淀, 发现两者都在Sur vivin和MDR1的启动⼦上p53结合区出现, ⽽ERa的这种共结合对p53的功能有抑制作⽤。⾮启动⼦序列的研究中, Re-ChIP也同样适⽤, Schnekenburger等[]采⽤Re-ChIP⽅法揭⽰了Dea cetylase 1和DNA Met hyltransferase 1复合体与染⾊体的结合是转录活性改变的重要标志。Wilkinson等[65]对p53和Smad蛋⽩在SBE/p53RE位置上的结合进⾏研究, 揭⽰转录⽣长因⼦介导的转录抑制作⽤。

要注意的是, ⾮同⼀复合体上的两个蛋⽩也可能都与底物⽚段结合, 因此Re-ChIP⽅法的结果也不能作为确定蛋⽩复合体提供绝对的证据。2.4 ChIP Chop

ChIP Chop是⼀另项建⽴在ChIP基础上的⽅法, 可以检测蛋⽩结合的DNA位置的甲基化情况。在实际的染⾊质免疫沉淀实验中, 5meC的抗体⽆法共沉淀甲基化DNA, 常导致甲基化DNA的共沉淀⽆法顺利进⾏。为了解决这个问题, Lawrence等[66]巧妙运⽤了核苷三磷酸盐依赖的性内切酶McrBC, 即等在进⾏过ChIP后, ⽤McrBC酶⽔解DNA, 随后再⽤跨越⽬的序列的引物进⾏PCR扩增。McrBC酶的特点是特异性剪切含有两个以上甲基化C⼆核苷酸的DNA[67], 如果DNA模版超甲基化, 则被

McrBC酶切断, 因此⽆法扩增出⽬的区段。相反, 低甲基化的模版对McrBC酶具有抵抗⼒, 则能扩增出⽬的⽚段。通过这种⽅法便可以确定出DNA结合抗原的位置是否发⽣了严重的甲基化。

此⽅法⾃提出后得到了许多研究者的亲睐, Preuss等[68]在rRNA基因沉默的研究中运⽤ChIP Chop, 评估结合了蛋⽩的DNA序列上胞嘧啶的甲基化密度。Earley等[69]采⽤此⽅法检测组蛋⽩结合的rRNA基因启动⼦上胞嘧啶去甲基化变化。2.5 ChIP-on-chip (Chromatin immuno-precipitation based on microarray)

ChIP-on-chip是⼀种全基因组范围内的定位分析技术, 建⽴于染⾊质免疫沉淀(ChIP)和芯⽚技术(Chip)的联合运⽤之上。⽤于分析细胞中DNA结合蛋⽩对特异结合位点, 包括启动⼦、增强⼦、抑制⼦、沉默⼦、绝缘⼦、边界元件, 以及DNA复制的序列的鉴定, 整体研究⽣物体发育和病变过程中的复杂信息⽹络, 是⼀个绘制基因组功能元件作⽤⽹络的技术平台。

对此技术的成功运⽤最早可追溯到2000~2001年的3篇⽂章中[70~72], 随后, ChIP-on-chip技术迅速发展并得以⼴泛应⽤2002年, Richard Young的团队[73]⽤c-Myc tagging system确定了酵母106个转录因⼦的全基因组的结合位点, 同年, Weinmann等[74]⽤其筛选转录因⼦的未知靶序列。⾃此, ChIP-on-chip开始成为全基因组⽔平描述组蛋⽩和许多因⼦作⽤情况的强⼤⼯具。通过

对ChIP-on-chip⽅法的运⽤, Testa等[75]揭⽰了NF-Y蛋⽩在核⼼启动⼦之外的多个的CCAAT结合位点, Liu等[76]在染⾊体组⽔平上全⾯检测了RE-a和ER-b 的结合位点。Wendt等[77]在最近发表的⽂章中全⾯运⽤了ChIP-on-chip技术, 在全基因组⽔平上检测了不同细胞时期的黏着素结合位点, 还对CTCF sites 位点在多个细胞系的分布做了描述, 其中运⽤了Affymetrix arrays,ENCODE arrays等不同的ChIP-on-chip类型, 芯⽚装载的DNA⽚段长度也各不相同, 可谓将ChIP-on-chip运⽤到了极致。由于哺乳动物基因组的庞⼤和⾼重复性, 过去的研究⼀般都集中于对候选因⼦功能的确定⽽⾮全基因组的分析, 然⽽随着近年来Nimblegen等公司的哺乳动物基因组芯⽚的问世, 研究者不需要预先考虑蛋⽩质的可能结合位点, 对哺乳动物在全基因组⽔平上进⾏⾼分辨率的DNA结合蛋⽩, 染⾊质构成等研究也就成为可能。

ChIP-on-chip作为⼀种新技术, 也有⼀些缺陷尚待改善。⾸先是成本较⾼, ⼀般公开发表的运⽤ChIP⽅法的研究中都⾄少重复3次以保证其可靠性, 其⾼昂的成本成为⼀些实验室运⽤此⽅法的因素; 其次, 对芯⽚实验得到的⼤量数据进⾏统计和分析, 规范实验程序, 制定确切的有⽣物学意义的实验标准等⽅⾯也尚待完善; 另⼀个因素是所能得到的DNA⽚段的⼤⼩, ⼀般的超声波裂解只能得到约200 bp的⽚段。但为了得到⾼分辨率的结果, 需要得到更⼩的甚⾄单核苷酸的⽚段, ⽬前公司提供的核苷酸序列从70 bp (Microarrays, Inc.)到25 bp(Affymetrix)不等。ChIP-on-chip所需的抗备也是⼀个障碍, ChIP-on-chip要求特异性很⾼的抗体, 要在⾃由溶液和固定液中都能识别其抗原决定簇(Epitope)。为了克服特异性的问题, ⽬的蛋⽩可与FLAG或HA等标签结合, ⽽FLAG或HA等能被抗体所识别, ⽽且, ⽬前亦可以获得抗某⼀特异性组蛋⽩修饰的抗体, 如H3K4me3等, 这些抗体和ChIP-on-chip的结合为组蛋⽩密码的破解和表观遗传学的发展打开了⼀扇⼤门。

需要说明的是, 之所以称ChIP为体内的研究⽅法, 主要是由于其相对体外⽅法⽽⾔, ChIP⽅法没有分别提取出核酸或蛋⽩, ⽽是直接对完整的细胞进⾏处理, 相对地保持了细胞内的核酸－蛋⽩质的原始互作状态。但其结果也具有⼀系列不确定因素: ⾸先,⽣物体内的核酸, 蛋⽩之间的互作具有时间、空

间的多样性, 瞬时的互作可能难以捕捉, ⽽偶然的靠近也可能被固定下来; 第⼆, 在交联、酶切、超声波破碎或其他处理过程中,核⼩体乃⾄染⾊质的状态都可能受到化学和机械的影响⽽发⽣改变。

我们旨在对研究核酸－蛋⽩相互作⽤的相关技术, 尤其是新技术进⾏概括与综述, 同时以最新的研究例证作为代表进⾏介绍与讨

论, 以期为读者进⾏相关研究提供有益的思路或线索; 因为篇幅的, 我们也不得不省略⼀些较传统的研究⽅法, 如化学修饰与性蛋⽩⽔解、DNA结合蛋⽩及其功能域的过表达技术等。总之, 随着⽣物化学⽅法的进⼀步发展以及化学、物理学、计算机科学、信息科学等学科的交叉协作, 核酸－蛋⽩质的研究⽅法将不断丰富和完善。相信在科学⼯作者们的不懈努⼒下, 对核酸－蛋⽩的互作机制的探究将更加深⼊, 对⽣命现象本质的理解将不断推进。