动物营养学报２０１８，３０（１）：１００—１０６ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－２６７ｘ．２０１８．０１．０１４ 牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测 王建郝丽媛魏婧雅孙鹏 （中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京１００１９３） 摘要：本试验旨在制备高纯度和特异性的牛乳铁蛋白多克隆抗体，为鉴定并定量检测牛奶样 品中及奶牛乳腺组织中合成的乳铁蛋白提供试验材料。选用４只健康新西兰大白兔，初次免疫 乳铁蛋白４周后进行加强免疫，每２周加强免疫１次，待血清达到抗体效价后，对兔进行心脏采 血并分离血清，利用饱和硫酸铵法和蛋白Ａ树脂纯化抗体，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电 泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）和免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ）法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。测定 纯化后抗体效价，并绘制抗体抑制曲线。最后利用所得抗体对市售液态奶、奶牛乳腺组织匀浆 液、奶粉样品中的乳铁蛋白进行定量检测。结果表明，本试验制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗 体纯度较高、特异性较强，抗体浓度为ｌ１．０２ ｍｇ／ｍＬ，效价达到ｌ：１２８ ０００；采用该抗体测定的乳 腺组织样品中乳铁蛋白浓度为１６．１３ ｌｘｇ／ｇ，液态奶中接近于０ Ｉ．ｚｇ／ｇ，奶粉中为５．２８ 抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，可以用于牛奶等产品的乳铁蛋白鉴定。 关键词：乳铁蛋白；多克隆抗体；抗体纯化 ｇ。总 之，本试验采用经过饱和硫酸铵法和蛋白Ａ树脂２步纯化后得到了纯度较高、特异性较强的兔 中图分类号：￥８５２．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—２６７Ｘ（２０１８）０１—０１００—０７ 酶联免疫吸附测定（ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ— ｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）方法是检测特定蛋白质的有效 近年来，人们对乳品质的要求越来越高，乳蛋 白作为衡量乳品质的重要指标，其合成的营养调 控已经成为奶牛营养学研究的热点。乳铁蛋白 （１ａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ，Ｌｆ）也称为乳运铁蛋白，是牛奶中重要 生物活性物质之一，具有调节铁吸收，广谱抗细菌 感染的作用 ｉ－２］，可以调节机体免疫反应，还具有 方法，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优 点。ＥＬＩＳＡ方法结合十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰 胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）可用于针对特定抗 抗氧化、抗癌、抗病毒等作用 Ｊ。乳铁蛋白在初乳 中浓度较高，人初乳中浓度为６～８ ｍｇ／ｍＬ；奶牛 初乳中浓度为ｌ～２ ｍｇ／ｍＬ；而在常乳中浓度较 原的定性和定量检测。利用此种方法检测生鲜乳 及乳制品中的乳铁蛋白浓度需要用到相应的乳铁 蛋白抗体，而Ｓｉｇｍａ公司出售的商品化抗体价格 低，人常乳中浓度为１～２ ｍｇ／ｍＬ，奶牛常乳中浓 度为０．０２～０．３５ ｍｇ／ｍＬ。由于人乳来源有限，因 昂贵，不适合大批量样品检测。因此，本试验通过 免疫新西兰大白兔来制备兔抗牛乳铁蛋白多克隆 抗体，旨在为研究奶牛乳铁蛋白的合成提供 有效的试验材料。为得到纯度较高、特异性较强 的抗体，通过饱和硫酸铵法和蛋白Ａ树脂对抗血 清进行纯化，纯化后得到的抗体用ＥＬＩＳＡ方法测 定其效价以及与乳铁蛋白的抑制率，以期为定量 此牛奶即成为人们获取乳铁蛋白的最直接途径。 为检测牛奶与乳制品中乳铁蛋白的浓度，有效降 低牛奶加工过程中造成的损失，需要建立一种快 速、准确的方法测定生鲜乳及乳制品中乳铁蛋白 的浓度 收稿日期：２０１７—０６—１２ 基金项目：国家重点研发计划（２０１６ＹＦＤ０５００５０７）；中国农业科学院科技创新工程（ＡＳＴＩＰ—ＩＡＳ０７）；国家高层次人才特殊支持计划 作者简介：王通信作者：孙建（１９９Ｏ一），女，山东潍坊人，硕士研究生，从事反刍动物营养研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｊｉａｎ一１８８４＠１６３．ｃｏｒｎ 鹏，副研究员，硕士生导师，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｕｎｐｅｎｇ０２＠ｃａａｓ．ｃｎ １期 王建等：牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测 １０１ 检测牛奶中以及奶牛乳腺中合成的乳铁蛋白提供 有效研究材料。 １材料与方法 １．１试验材料 试验材料包括乳铁蛋白标准品（美国Ｓｉｇｍａ 公司，纯度≥８５％）、弗氏完全佐剂（美国Ｓｉｇｍａ公 司）、弗氏不完全佐剂（美国Ｓｉｇｍａ公司）、蛋白Ａ 树脂（美国Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ公司）、羊抗兔辣根过氧化物 酶标记的免疫球蛋白Ｇ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ—ｈｏｒｓｅ— ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ，ＩｇＧ—ＨＲＰ）（武汉博士德生物工程 有限公司）。乳腺组织样品采自中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所昌平试验基地；液态奶样品 为市售超高温灭菌乳；奶粉样品为市售品牌普通 奶粉。 １．２试验动物及饲养管理 试验选取４只健康纯种新西兰大白兔，单笼 饲养，每日饲喂颗粒饲料（饲料中不含酪蛋白），自 由采食和饮水。饲养前对兔舍进行彻底清扫和消 毒，待兔适应饲养环境ｌ周后，耳缘静脉采血，测 定其血清是否与乳铁蛋白有反应，血清与乳铁蛋 白无反应性的合格兔子按免疫程序进行免疫。 １．３免疫程序及抗血清的制备 乳铁蛋白抗血清的制备参考Ｙｏｕ等 的方 法。试验第ｌ周，将弗氏完全佐剂与乳铁蛋白溶 液等比例乳化完全后，采用皮下多点注射法，每只 兔注射ｌ ｍＬ乳化液（含５００ ｔｘｇ乳铁蛋白），４周 后，同样方法背部皮下多点注射经弗氏不完全佐 剂乳化完全的乳铁蛋白（含２５０ ｔｘｇ乳铁蛋白），以 后每２周重复１次，每次免疫后的第７天耳缘静脉 采血，ＥＬＩＳＡ方法检测抗血清效价。第４次免疫 后的第７天进行心脏采血。待血液凝结后，于 ９４０ｘｇ离心２０ ｍｉｎ，取上清液分装后置－８０ ｏＣ保存 备用。 １．４饱和硫酸铵法纯化抗血清 饱和硫酸铵纯化参考庞学燕等 的方法配 制，取５００ Ｌ血清加入等体积的磷酸盐缓冲液 （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４），冰浴下逐滴加入２５０ Ｌ饱和硫酸铵溶液， 旋涡混匀，４℃静置３０ ｒａｉｎ，４℃、１ ５５０ ｘｇ离心 １５ ｒａｉｎ，取上清液。在上清液中逐滴加入ｌ ０００ Ｌ 饱和硫酸铵溶液，旋涡混匀，４℃静置３０ ｍｉｎ，离心 弃上清液。沉淀用５００ ＰＢＳ溶解，在溶液中逐 滴加入２５０ Ｌ饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，４℃ 静置３０ ｍｉｎ，４℃离心，保留沉淀。沉淀继续用 ＰＢＳ溶解，滴加饱和硫酸铵溶液，静置，离心，保留 沉淀。将沉淀溶于ＰＢＳ中，装入透析袋中４℃透 析过夜。 １．５ 蛋白Ａ树脂纯化抗血清 参考庞学燕等 的方法，采用蛋白Ａ树脂纯 化抗血清。向纯化柱中加入ｌ ｍＬ结合／洗涤缓冲 液，将１ ｍＬ混匀的蛋白Ａ树脂加入柱中，再向柱 中加入５ ｍＬ结合／洗涤缓冲液以平衡柱子，流速 约１ ｍＬ／ｍｉｎ。将结合／洗涤缓冲液稀释后的血清 样本加入柱中，保持流出速度约为ｌ ｍＬ／ｍｉｎ。用 ３０ ｍＬ结合／洗涤缓冲液冲洗柱子并使缓冲液流出 速度约２ ｍＬ／ｍｉｎ，用１５ ｍＬ洗脱缓冲液洗脱抗 体，保持洗脱液流速约１ ｍＬ／ｍｉｎ。将含有抗体的 洗脱液收集到含平衡缓冲液的烧杯中以中和洗脱 液ｐＨ至７．４。洗脱出来的抗体溶液装入透析袋中 ４℃透析过夜。 １．６ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定纯化后抗体纯度 配制１２％的分离胶和５％的浓缩胶，取８０ Ｌ 抗体样品与２０ Ｌ ５×上样缓冲液混匀，在沸水中 煮沸５ ｍｉｎ。每孔上样１２ Ｌ，电压调为８０ Ｖ开始 电泳（ＰｏｗｅｒＰａｃ ３０００型电泳仪，美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公 司），当指示染料进入分离胶后，将电压调至 １２０ Ｖ，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约 １ ｃｍ处停止电泳，固定液固定，考马斯亮蓝染色， 脱色液脱色，直至条带清晰可辨，用凝胶成像系统 拍照观察。 １．７ ＥＬＩＳＡ方法检测纯化后抗体的效价 抗体效价的检测采用ＥＬＩＳＡ方法 Ｊ。将乳铁 蛋白标准品用包被液稀释至０．３１ Ｉｘｇ／ｍＬ，每孔 １００ Ｌ包被酶标板，４℃过夜，并用ＰＢＳ做阴性对 照，次日弃去孔内液体，每孔加入２００ Ｌ封闭液 ［１％卵清白蛋白（ＯＶＡ）］，置３７℃恒温箱１ ｈ，倾 去液体后，用磷酸盐吐温缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．ｂｕｆｆ－ ｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｔｗｅｅｎ，ＰＢＳＴ）洗涤４次，每次静置３ ｍｉｎ 后迅速倾去洗涤液，拍干。取不同稀释度 （１：２ ０００、ｌ：４ ０００、ｌ：８ ０００、ｌ：１６ ０００、１：３２ ０００、 ｌ：６４ ０００和１：１２８ ０００）的纯化后抗体，每个稀释度 ３个重复，３７℃温育１ ｈ，然后倾去液体，ＰＢＳＴ洗 涤，倾去液体，拍干。每孔加１００ Ｌ按１：５ ０００稀 释的羊抗兔ＩｇＧ—ＨＲＰ抗体，３７℃温育１ ｈ，ＰＢＳＴ 洗涤，倾去液体，拍干。每孔加入１００ Ｌ新鲜配 动物营养学报 制的四甲基联苯胺（ＴＭＢ）底物溶液室温孵育 ２０ ｍｉｎ。每孔加入５０ Ｌ终止液（２ ｍｏＶＬ硫酸）， ５ ｍｉｎ后在酶标仪上测定４５０ ｎｍ下的吸光度 （ＯＤ ）值。若待测孔ＯＤ 。 值大于或等于阴 性对照孔的２．１倍，即认为是阳性值，从而得出抗 体的效价。 １．８乳铁蛋白的测定工作曲线 用竞争性ＥＬＩＳＡ测定抗体与乳铁蛋白之间的 抑制率 Ｊ。将抗体作适当浓度稀释后，以等体积 分别与系列倍比稀释（４０ ０００、２０ ０００、１０ ０００、 ５ ０００、２ ５００、ｌ ２５０、６２５、３１２．５ ｎｇ／ｍＬ）的乳铁蛋 白混匀后，室温反应１５ ｒａｉｎ。然后加至已包被处 理的酶标板中。其余步骤同１．７。根据ＯＤ 值 绘制标准曲线，计算抗体与乳铁蛋白的抑制率。 １．９乳腺组织及乳制品中乳铁蛋白浓度的测定 将从屠宰场采集的奶牛乳腺组织样品迅速放 入液氮保存。测定时，将乳腺组织样品取出后，倒 入液氮进行研磨，称取一定量乳腺组织样品，充分 溶解于５倍体积的ＰＢＳ中，同时加入放射免疫沉 淀测定裂解液（ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，ＲＩ— ＰＡ）和蛋白酶抑制剂，１２ ０００ｘｇ离心１０ ｍｉｍ跚髂∞ ｎ，取上 船 ∞ 嚣 清液，用二辛可酸（ＢＣＡ）蛋白质浓度测定试剂盒 检测待检样品中总蛋白质的浓度。取１ ｍＬ液态 奶，加入蒸馏水进行稀释后，３ ０００ｘｇ离心１０ ｒａｉｎ， 去除上层脂肪。加入ｌ ｍｏｌ／Ｌ稀盐酸调节ｐＨ为 ４．６，去除酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品。取３ ｇ奶粉样 品，加水定容至１００ ｍＬ，离心去除脂肪和酪蛋白后， 得到乳铁蛋白粗品。利用乳铁蛋白测定工作曲线，检 测乳腺组织、液态奶及奶粉中乳铁蛋白的浓度。 １．１Ｏ 免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）鉴定纯化后 抗体特异性及反应性 将乳铁蛋白纯品溶于ＰＢＳ中，奶牛乳腺组织、 液态奶和奶粉前处理方式同１．９。以总蛋白质浓 度作为ＳＤＳ—ＰＡＧＥ上样量依据，配制１２％分离胶 和５％浓缩胶，对乳铁蛋白纯品、奶牛乳腺组织、液 态奶和奶粉样品进行电泳，电泳结束后将蛋白质 转移到预先用甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜（ｐｏｌｙ— ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｌｆｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）上，利用０．５％的鸡血 清进行封闭，将乳铁蛋白多克隆抗体溶液按 ｌ：６ ０００稀释后，室温孵育２ ｈ，ＰＢＳＴ洗后加入羊 抗兔辣根过氧化物酶标记ＩｇＧ抗体（１：５ ０００稀 释），ＰＢＳＴ洗膜，二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色剂显 色后扫描结果。 ２结果与分析 ２．１ 乳铁蛋白多克隆抗体纯度 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ结果如图ｌ所示，经过饱和硫酸铵 法和蛋白Ａ树脂２步纯化后得到的乳铁蛋白多克 隆抗体重链清晰可见，表明通过纯化得到了纯度 较高的乳铁蛋白抗体。 １：蛋白质分子质量标准；２：纯化后的多克隆抗体。 １：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄ；２：ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙ— ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． 弱 ¨ｕ 图１纯化后多克隆抗体的电泳图 Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２．２乳铁蛋白多克隆抗体效价 用ＢＣＡ蛋白质浓度测定试剂盒测得乳铁蛋 白多克隆抗体浓度为ｌ１．０２ ｍｇ／ｍＬ。图２为多克 隆抗体的效价曲线，抗体经过纯化以后，ＥＬＩＳＡ方 法检测抗体的效价为ｌ：１２８ ０００。 ２．４ Ｏ．４ ０ ２ ０００ ２２ ０００ ４２ ０００ ６２ ０００ ８２ ０００ １０２ ０００ １２２ ０００ 抗体的稀释度Ｄｌｕｔｉｏｎ ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ 图２兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体效价曲线 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ—ｂｏｖｉｎｅ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ Ｓ２ １期 王建等：牛乳铁蛋白多克降抗体的制备、纯化及定ｆｉ｝检测 ２．３抗体与乳铁蛋白的抑制率 抗体与乳铁蛋白的抑制率见图３，抑制抗原与 抗体结合５０％时乳铁蛋白的浓度（ＩＣ ）为 ２４．５５ ｉ￣ｇ／ｍＬ。测检出限时，乳铁蛋白设ｌ０个浓 度梯度，从ｌ ０００ ｇ／ｍＬ起始２倍等比稀释到 １．９５ ｉ．ｔｇ／ｍＬ，每个浓度设６个重复，线性范围ｌｌ～ ４０ ｂｔｇ／ｍＬ，检出限为ｌ１．４８ ｉｘｇ／ｍＬ。 ｌ。０ １．】 Ｉ＿１ ４．３ ４．１ １．Ｓ ４．６ 乳铁蛋白浓度的常用对数 Ｃｏｍｍｏｎ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 图３抗体与乳铁蛋白的抑制率 Ｆｉｇ．３ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ２．４乳腺组织及乳制品中乳铁蛋白浓度的测定 利用工作曲线测定乳腺组织样品及乳制品中 乳铁蛋白浓度，测得５份乳腺组织样品中乳铁蛋 白浓度范围在１４．７２一ｌ８．６４ ｔｘｇ／ｇ，平均值为 ｌ６．１３ ｔｘｇ／ｇ，相对标准偏差为¨．０５％，液态奶中乳 铁蛋白浓度接近于０ Ｉ￣ｇ／ｇ，奶粉中乳铁蛋白浓度 范围为４．９ｌ～５．７３ Ｉｘｇ／ｇ，平均值为５．２８ Ｉ．ｔｇ／ｇ，相 对标准偏差为６．４２％。 ２．５乳铁蛋白抗体特异性 Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ结果如图４所示，纯化后的抗体 能够与乳铁蛋白标准品专一性结合，表明得到的 抗体能够特异性识别乳铁蛋白。 图５显示，纯化后的抗体与奶牛乳腺组织中 提取的乳铁蛋白具有反应性，同时对奶粉中的乳 铁蛋白也有特异反应性，可用于检测奶牛乳腺组 织和乳制品中的乳铁蛋白。途中条带的粗细可初 步反映样品中乳铁蛋白浓度的差异，由图可以看 出，奶粉中乳铁蛋白浓度高于乳腺组织及液态奶 样品 Ｍ Ｍ：蛋白质分子质量标准；１～２：乳铁蛋门。 Ｍ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄ；ｌ ｔｏ ２：ｌａｃｔｏ一 图４ Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ法鉴定乳铁蛋白抗体特异性 Ｆｉｇ．４ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ ｋｕ Ｍ （）（） ７５ 豢 Ｍ：蛋［ｊ质分了质地标准；１：液态奶样【 ２～３：乳腺组 织样品；４：奶粉样品 Ｍ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄ：ｌ：ｌｉｑｕｉｄ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ；２ ｔｏ ３：ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ；４：ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ｓａｍｐｌｅ． 图５ Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法鉴定奶牛乳腺组织及 乳制品中提取的乳铁蛋白与抗体的反应性 Ｆｉｇ．５ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｄａｉｒｙ ＣＯＷＳ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ ３讨 论 牛奶中含有多种生物活性物质，例如抗毒素、 抗细菌和抗病毒以及刺激免疫系统的成分。其 中，乳铁蛋白即是一种多功能蛋白质，具有与铁元 素结合的特性，不仅可以促进铁的吸收，同时兼具 抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗炎症、抗氧化和免疫调 控等作用 ‘‘～ 。Ｈａｂｉｎｇ等 ” 研究发现，乳铁蛋白 还可以降低断奶前腹泻犊牛的死亡率。目前针对 乳铁蛋白的检测方法主要有高效液相色谱法 ’ 、 放射免疫扩散法… 以及ＥＬＩＳＡ方法 １３］等。 １０４ 动物营养学报 ３０卷 高效液相色谱法利用色谱柱根据样品分子质 性对照的吸光度值之比大于２．０的最大的抗体稀 释度。本试验中的多克隆抗体血清来自４只用乳 量的差异分离蛋白质，其测定结果准确可靠，精密 度高，重复性好；但仅适合于高纯度样品测定，如 果样品中乳铁蛋白浓度较低时，由于乳铁蛋白与 其他杂蛋白质分子质量相近，在凝胶色谱上的保 留时间相近，很难将各组分区分开，进而影响定量 铁蛋白免疫的新西兰白兔。在血清稀释倍数最大 为１２８ ０００时，仍然为阳性反应，证明最终的抗体 效价为１：１２８ ０００。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法证明本试验中 制备的多克隆抗体与乳铁蛋白标准品可特异性结 合，且可用于检测奶牛乳腺组织中以及奶粉中的 乳铁蛋白。本试验中奶牛乳腺组织、市售液态奶 及奶粉样品中的乳铁蛋白检测结果不尽相同，证 结果＿１ 。且高效液相色谱法需要的仪器较为昂 贵。龚广予等 利用放射免疫扩散法检测婴幼儿 配方奶粉中的乳铁蛋白，利用抗原抗体反应形成 沉淀带的原理计算乳铁蛋白浓度，准确性稍差。 而ＥＬＩＳＡ方法操作相对简便，准确性好，对于乳及 乳制品中浓度相对较低的乳铁蛋白而言，该方法 灵敏度高，且对样品纯度要求不高，检测限较低， 适合于乳铁蛋白的检测 。因此，制备乳铁蛋白 抗体是目前检测牛奶及奶牛乳腺中合成的乳铁蛋 白的优选措施。与普通抗血清相比，特异性抗体 的制备要求对相应抗血清进行纯化，其制备步骤 更为复杂，但抗体的效价相对较高。针对牛奶中 的多种生物活性蛋白质，已经得到了包含兔抗牛 Ｂ一酪蛋白、Ｏ￣Ｓ－－酪蛋白和Ｋ一酪蛋白以及乳铁蛋白 等的抗血清 增Ｊ，早期沈新义等 利用乳铁蛋白 免疫家兔得到的抗血清效价仅为１：１０ ０００，李 岩 剐利用乳铁蛋白免疫新西兰大白兔和高产罗曼 蛋鸡，得到的抗血清效价仅为１：４８ ０００，与本试验 中特异性抗体的效价相差甚远。 以往研究中针对抗体的纯化方法多为单一纯 化方法，常见的有盐析法、离子交换层析法和亲和 层析法等。盐析法利用蛋白质在高浓度盐溶液中 形成沉淀的原理分离纯化蛋白质，离子交换层析 法利用离子交换树脂与蛋白质的选择性结合而分 离蛋白质，而亲和层析法则是利用蛋白质与介质 中配基的特异结合而分离纯化蛋白质。由于以上 方法的原理不尽相同，其纯化抗体后的纯度也相 差甚远，例如，通过饱和硫酸铵盐析法得到的抗体 纯度一般在７５％左右，而利用亲和层析法纯化后 的抗体纯度可达９０％以上＿４ Ｊ。本试验中在分析比 较了前人所用方法的基础上，先后通过饱和硫酸 铵法和蛋白Ａ树脂２种方法纯化了抗体，经ＳＤＳ— ＰＡＧＥ电泳后看到抗体条带清晰，且纯度较好，抗 体浓度为ｌ１．０２ ｍｇ／ｍＬ。 抗体滴度，即抗体效价，用抗体的稀释倍数表 示，是指某一抗体经稀释后能与抗原结合并出现 可见反应的最高稀释倍数；或者是稀释抗体和阴 明不同样品中该物质浓度有所差异。研究表明， 乳铁蛋白由机体外分泌腺分泌，主要存在于乳汁 中，同时在泪液、唾液、血浆、胆汁、胰液和嗜中性 粒细胞中也有存在＿２ 。其在初乳中浓度最高，常 乳次之，而本试验中检测到其在奶粉样品中浓度 稍高，证明奶粉中可能含有外源添加的乳铁蛋白。 由于乳铁蛋白具有多种生物学功能，有利于人体 健康而无毒副作用，目前已成为允许在婴幼儿配 方奶粉以及食品中添加的物质之一＿２ 。本试验中 液态奶中乳铁蛋白浓度偏低可能与其加工储存方 式有关。通过利用本试验中制备的抗体检测不同 样品中乳铁蛋白浓度的差异结果表明，该抗体可 有效反映样品中乳铁蛋白的浓度。 ４ 结 论 本试验通过免疫新西兰大白兔成功制备了纯 度较高、特异性较强的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗 体，抗体浓度为ｌ１．０２ ｍｇ／ｍＬ，效价达到 ｌ：１２８ ０００，该多克隆抗体可以与乳铁蛋白特异性 结合，可用于定性鉴定和定量检测牛奶中以及奶 牛乳腺合成的乳铁蛋白，为后续奶牛乳铁蛋白合 成的研究工作的开展奠定了基础。 参考文献： ｆ １］ ＫＩＥＣＫＥＮＳ Ｅ，ＲＹＢＡＲＣＺＹＫ Ｊ，ＢＡＲＴＨ Ｓ Ａ，ｅｔ ａ１． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ０１５７：Ｈ７ ｓｔｒａｉｎｓ ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，２０２：２９—３７． 『２］ ＲＹＢＡＲＣｚＹＫ Ｊ，ＫＩＥＣＫＥＮＳ Ｅ，ＶＡＮＲＯＭＰＡＹ Ｄ， ｅｔ ａｌＪ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ０１５７：Ｈ７ ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，２０２：２３—２８． 『３］ ｗＡＫＡＢＡＹＡＳＨＩ Ｈ，ｏＤＡ Ｈ，ＹＡＭＡＵＣＨＩ Ｋ，ｅｔ ａ１． Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１４，２０ １期 （１１）：６６６－６７１． 王 建等：牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测 １０５ ｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，９７（８）：４８３２—４８３７． ［４］ Ｙ０Ｕ Ｊ Ｍ．ＳＵＮ Ｐ，ＬＩ Ｄ Ｆ，ｅｔ ａ１．．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ Ｕ— ｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏ—ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｂ— ［１２］ 龚广予，巫庆华，吴正钧，等．一种检测乳铁蛋白的方 ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓ— ｔｒｙ，２００９，ｌｌ７（２）：３７１—３７４． 法——放射免疫扩散法［Ｊ］．中国乳品工业，２００１，２９ （３）：２７—２９． ［５］ 庞学燕，季昀，王洪荣，等．奶牛ＯｒＳ一酪蛋白多克隆抗 体的制备、纯化及鉴定［Ｊ］．动物营养学报，２０１２，２４ （１１）：２１９０—２１９４． 许时婴，王璋．乳铁蛋白测定方法的比较 ［１３］ 卢蓉蓉，［Ｊ］．中国乳品工业，２００２，３０（５）：１２３—１２５． ［１４］ 李姣，张施敬，佘之蕴，等哥Ｌ铁蛋白纯化和检测方法 大豆主要抗营养因子检测技术研究及初步 ［６］ 黑文静．研究进展［Ｊ］．广东化工，２０１４，４１（１４）：１２３—１２４， 应用［Ｄ］．硕士学位论文．北京：中国农业大学，２０１２． ［７］ ＭＵＲＡＴＡ Ｍ，ＷＡＫＡＢＡＹＡＳＨＩ Ｈ，ＹＡＭＡＵＣＨＩ Ｋ， ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉ— ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ『Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，９６（８）：４８９１—４８９８． ［８］ ＣＡＲＶＡＬＨＯ Ｃ Ａ Ｍ。Ｓ０ＵＳＡ Ｉ Ｐ Ｊｒ．ＳＩＬＶＡ Ｊ Ｌ。ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｌａｃｔ— ｏｆｅｒｉｆｎ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１４，４５２／４５３：２９７—３０２． ［９］ ＺＨＡＮＧ Ｊ Ｓ，ＬＡＩ Ｓ Ｙ，ＣＡＩ Ｚ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｕｌｔｒａ·ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｍ— ｐｌｏｙｉｎｇ ａｎ ｉｓｏｔｏｐｅ—ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｎｇｅｄ ｐｅｐｆｉｄｅ ａｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２０１４，８２９：３３— ３９． ［１０］ＨＡＢＩＮＧ Ｇ，ＨＡＲＲＩＳ Ｋ，Ｓ Ｇ Ｍ，ｅｔ １ａ．Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｐｒｅｗｅａｎｅｄ ｃａｌｖｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｒｒｈｅａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，１００ （５）：３９４０—３９４８． ［１１］ＴＳＡＫＡＬＩ Ｅ，ＰＥＴＲＯＴＯＳ Ｋ，ＣＨＡＴＺＩＬＡＺＡＲＯＵ Ａ， ｅｔ ａ１．Ｓｈｏｒｔ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｎ Ｆｅｔａ ｃｈｅｅｓｅ ｗｈｅｙ ｗｉｔｈ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ·－ｐｅｒ－－ １３０． ［１５］ 李震，陈永福．牛乳中Ｂ一酪蛋白检测的ＥＬＩＳＡ方法 ［Ｊ］．山东农业大学学报：自然科学版，１９９９，３０（４）： ４５ｌ－４５２． ［１６］ 张涛，庞广昌．酶联免疫法快速测定原料乳中ＯｒＳ一酪 蛋白质量浓度［Ｊ］．中国乳品工业，２００６，３４（２）：５６－ ５８． ［１７］ 张涛，庞广昌．酶联免疫法快速测定原料乳中．ｃ一酪 蛋白含量［Ｊ］．食品工业科技，２００６，２７（１１）：１７９－ １８１． ［１８］ 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ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ａｇａｉｎ ａｆｔｅｒ ４ ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅｒｅａｆｔｅｒ，ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｏｎｃｅ ｅｖｅｒｙ ２ ｗｅｅｋｓ ｕｎｔｉｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ ｄｅｓｉｒａｂ１ｅ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｐｕｆｆ— ｆｉｅｄ ｂｖ ｔｈｅ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ．Ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅ１ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ．ＰＡＧＥ）ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐｕｆｆｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｎ‘ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｗｅ ｌｅｄ ａｎｔｉｆｂｏｄｙ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｍｉｌｋ，ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｄａｉｒｙ ＣＯＷＳ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ—ｂｏｖｉｎｅ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ １ １．０２ ｍｇ／ｍＬ， ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ １：１２８ ０００：ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｄａｉｒｙ ＣＯＷＳ ｗａｓ １６．１３ ｔｘｇ／ｇ， ｔｈａｔ ｉｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｍｉｌｋ ｗａｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ０，ａｎｄ ｔｈａｔ ｉｎ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ｗａｓ ５．２８ Ｉｘｇ／ｇ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｌａｃｔｏ— ｆｅｒｒｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｃｉｔｙ ｗａｓ ｐｒｅｐａｆｒｅｄ ｂｙ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｄｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｌｉｋｅ ｍｉｋ．［Ｃｈｉｌ＿ ｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１８，３０（１）：１００－１０６ Ｊ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ；ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｛Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｐｅｎｇ０２＠ｃａａｓ·ｃａ （责任编辑王智航）
