２９４ ＴＵＭＯＲ（Ｓｈａｎｇｈａｉ１ Ｊｕｌｙ ２（）（１ｌＩ，Ｖｏｌ ２０ Ｎｏ．１ ＣａＣＩ 和高压电穿孔法转化效率的比较 １００ ｎｇ ＳＫ ＥｃｏＲＶ酶切时间对蓝斑数目的影响 自制Ｔ Ａ载 （一）超螺旋质粒分别用两种方法转化感受态细胞， 体连接产物一般都有较高的背景，即蓝斑数目较多， ＣａＣＩ 转化效率为ｄ×１０ ，高压电穿孔法转化效率８ 虽然影响不大，但在连接物少，连接效率低的情况 ×１０ （单位：菌落数／ｌ ｇ超螺旋质粒），后者为前者 下，大量蓝斑会增加白斑挑取的难度 造成这种情况 的２０倍；取切胶纯化的ＰＣＲ产物ｌ５ ｎｇ与ｌ０ ｎｇ的 的原因是在制备载体时，ＥｃｏＲＶ酶切不完全．而残 自制Ｔ Ａ载体进行连接．ＣａＣ１ 法重组子数为８，高 存的环状质粒又有极高的转化效率，因此形成大量 压电穿孔法为ｄ２，效率较前者提高５倍，表明高压 不舍插入片段的蓝斑，虽然我们用电泳来鉴定酶切 电穿孔可以大幅度提高克隆效率。 程度，但痕量的环状质粒是无法发现的，因此我们希 Ｔａｑ酶处理时间对连接效率的影响 质粒载体的粘 望延长酶切时间来相对增加酶切程度。ＳＫ（ ）质粒 端Ｔ是由Ｔａｑ酶加上的．酶的品质，镁离子的浓度 用ＥｃｏＲＶ分别酶切２ｏ ａｒｉｎ、２ ｈ、８ ｈ，各取１０ ｎｇ．高 和作用时间都可能对连接效率产生影响。这里我们 压电穿孔转化感受态细胞，培养基上的蓝斑数目分 研究了作用时间的影响：ＥｃｏＲＶ酶切ＳＫ（一）质粒 别为４００、５６、６０，提示酶切的时间至少应大于１小 ８小时，Ｔａｑ酶分别处理１０ ｒａｉｎ、１、２、４ ｈ，各取ｌ０ 时。 ｎｇ，连接ｌ２ ｈ，电穿孔转化，重组干数目０、５ｌ、２２、 ｄ ２，提示处理至少应在 小时以上，超过２小时则意 参考文献 义不大。 ［１］Ｍａｒｃｈｕｋ Ｄ、Ｄｒｕｍｍ Ｍ，Ｓａｎｌｉｎｏ Ａ ｅｔ ａ＿＿Ｃｏｎｓｔ ｒＬ ｌｃ【ｉｏｕ ０『ｒ ｖ ｃ 连接反应时间对连接效率的彤响 Ｅｃ０ＲＶ酶切ＳＫ ｔ０ｒｓ．ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｙｓｔｅｎ】［ｏｒ ｄｉｒｅｃ【ｃ Ｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ （一）质粒８小时，Ｔａｑ酶处理２小时，各取１０ ｎｇ，连 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｊ］Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒ．１９９１．１９：１１ 【 接１２、２４、蝎ｈ，电穿孔转化，重组子数日３５、４２和 ［归Ｆ．奥斯伯一Ｒ．布伦特．Ｒ Ｅ金新顿等著．橱于颢等ｉ千：桁！＿ｉ；丹ｆ 生物学实验指南：Ｍ］．科学山版杜．１ １》９８：２２～２３ ３Ｏ个。有文献报道，连接反应应为４８ ｈ，我们的结果 （收稿Ｈ；ＩＩＪ １ ９９９ ｌｎ ｌ０） 显示，连接１２ ｈ已经足够．过长的时间毫无必要，还 作者简介：孙奋勇．男．博士研究生。 大大延长了实验周期 （本文编辑：马积庆 一一一一一一一＋ （上接第２６８页） ’ｃＧＴｃｃＡｃＡＡＧＡＧＧＧＡＡＴＡｃＴＧＡ 晴显高于未复发病例 ＜ｏ．０５） ９例发生癌变（癌变者平均 ＴＣ— ‘．扩增产物位于Ｉ １区４４８～ｄ５ ｂｐ 反应条件为９４ Ｃ 年龄５８．２岁）．癌变率３０ ｛１９例有慢性鼻炎病史。 变匪４５ ．５５ Ｃ退火６０ ，７２ Ｃ延伸６０ ．共循环３５欢。（以 讨 论 上 １物、ＨＰＶ质粒厦Ｂ９５ ｇ细胞系由全军基因诊断技术应 ｓＮＩＰ虽属良性，但可破坏周围软组织和骨质．田除后易 用研究所提供）。 复发，井有较高的恶变率．故有人将其 属于良性与恶性之 （３）结果判断取扩增产物【０ Ｊ １加溴酚蓝２ Ｉ．以ＰＣＲ 间的边缘性肿瘤、癌前状态、或潜伏恶性肿瘤。Ｉ ９８７年Ｓｙｒ Ｍａｒｋｅｒ作ＤＮＡ标准分子｝Ｉ｝耐照．点样于２ 琼脂糖凝胶． Ｊａｎｔｎ等首次用原位杂交方法从ＳＮＩＰ中榆出丁ＨＰＶ基因。 Ｖ电压下电泳５０ ｍｉ．．演化己锭染色．紫外光下观察结 以后研究都支持ＨＰＶ感染是ＳＮ１Ｐ的病因之一．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ 果 每竹标本扩增３欢，如电滹条带弱无法判断结果，可取扩 等用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法首次从２（）例鼻ＳＮＩＰ中榆出 增产物 ｊ ｌ作为模板，用两韫魔点法（９４ ｃ变性５【）ｓｔ ６８ Ｃ ＨＰＶ ９倒ｔＥＢＶ ｌ ３倒ｔ提出ＥＢＶ有可能象ＨＰＶ一样作为 退火一延伸ｌ ｍｉｎ）行二次扩增 仍无明显条带者判为阴性 内翻性乳头状瘤的病因，或起到 同作用。而Ｇａｆｌｅｙ等 为 结 果 内翻性乳头状瘤可能与ＥＢＶ无关。本研究３（）倒ＳＮＩＰ中 Ｉ 聚台酶链反应结果 ＨＰＶ和ＥＢＶ的感染率分别为６６．７ 和４ ｃ １ｈ；ｉ．其中 例为 ３（》例ｓＮＩＰ及恶变组织中｝盘出ＨＰＶ ２０例（６６．７ ）、 两者混台惑槊，而ｌ０例鼻息肉中未榆出ＨＰＶ和ＥＢＶ＝提示 ＥＩＷ １ ２例（４０ ） 其中２１例鼻腔、副鼻窦内商性乳头状瘤 内葫性乳头状瘤与ＨＰＶ感染有关．租可能与ＥＢＶ世有关 本文中９例乳头状瘤恶变中榆出Ｈｒｖ阳性５例，且全部为 中榆出ＨＰＶ单独感染１ｌ例，ＥＢＶ单独感染３例，ＨＰＶ和 ＨＰＶ 型，说喝ＨＰＶ． 型与乳头状瘤恶嗖有关．与以往研究 ｎＶ混合感染４例｝９例乳头瘤恶变中检出两者混台感染１ 结果一致 倒，ＨＰＶ单独感染４例（全部为ＨＰＶ． 型，ＥＢＶ单独感染４ 有关ＨＰＶ与ＳＮＩＰ复发的关系尚有争论 本组的复发 倒， 乳头状瘤恶变中１（１【ｌ 存在一种或两种肿瘤病毒的感 和未复发者中ＨＰＶ的感染率接近，而ＥＨＶ的感染率在复发 染；１ ０例鼻息肉中未榆出ＨＰｖ和ＥＢＶ。 者中明显高于未复发，说唱ＥＢＶ在内翻性乳头状瘤的复发 ２丰组３（）倒内翻性乳头状瘤中有１３例复发２收以 中起一定的作用 上．复发率４２ ５ ；＂例未复发。复发和未复发者ＨＰＶ的 （收稿：ｌ ９—０２ 悔Ｍ：ｌ９。 Ｉ＿ｌ ｌ６】 感染分别为８例（６ｌ ０ ）和ｌｌ例（６ ７ ），ＥＢＶ的感染分 作者简介 高鹏飞，男．硕士，讲师 别为ｆｉ例（１ ６．２ ）和１倒（ｊ ９ ），ＥＩ％Ｖ感染率在发病例中 （本文蹁辑：戴峰）
