要比较不同切片的光密度值来确定它们之间的蛋白表达的差异，首先要注意的就是这些切片样品要个样品定位后，各切出一个小细条，整整齐齐排成一个阵列，包埋在蜡块中，切成一片切片，然后不仅它的的切片染色条件一致，还节省了抗体试剂。
切片当然首先得拍成照片才能进行分析。拍照也是一个重要环节，在显微镜下拍摄免疫组化照片需1.所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的3.免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正那张不好。
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• 【Science】肿瘤特刊：抗癌40年
hbchendl
2006-04-07 18:22
打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。
点开intensity calibration窗口后，选std option density，并点option按纽，
发标移到图片的空白处点一下，就可以看到current value的值会显示出点击部位的灰贴: 1432 片则只有200甚至更低。 积一张照片的背景强度不会是完全一样的。所以要在照片各个不同的空白处都点一下，分: 132 所以最后确定的背景值只能是取它们的折中。 得较正背景的值会在曲线的X轴端中表现出来。 票: 160 丁当: 986
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• 【招聘】核力康健生物医药技术(天津)有限公司招聘CTO助理、市场部专员和实
hbchendl
2006-04-07 18:39
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光密度校正窗口可以放在屏幕上随时检查，有时候在切换了图片后其光密度校正值会
现在可以调出count/size窗口，先选择测量项目，前面说过density mean是不合适
贴: 1432 不大。所以可以选用IOD与area两个测量项目。当然把选中区域转换成灰度图片再积另外对option也要适当设置一下。 分: 132 得
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• 【转载】结核杆菌检测有了新技术 阳性检出率从25%提高到60%以上
hbchendl
2006-04-07 18:50
然后要保存count/size窗口的设置，点count/size窗口的 file -- save setting得以后找不到。文件扩展名是 .env 。保存这个文件的目的是为了制作宏操作用的。
发
贴: 1432 下面就可以选择颜色了，点select colors ,取HSI颜色系统，S与I都选0到255
积
分: 132 然后也要保存颜色设置文件。 得
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• 【招聘】核力康健生物医药技术(天津)有限公司招聘CTO助理、市场部专员和实
hbchendl
2006-04-07 18:59
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贴: 1432 积
分: 132 得
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下面就可以测量光密度值了，点count，然后到statistics窗口中查看测量值。 IOD SUM 与area SUM是有意义的测量值。IOD SUM是图片中黄色区域的累积光密度
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• 【交流】《柳叶刀》2010年2424名审稿人全球70个国际（地区）分布情况
hbchendl
2006-04-07 19:22
如果想要测准一点，就需要把选中区域复制下来，再转换成灰度图片后再测量光密度1.选好颜色区域后，在preview中选transparent on white，这时图片中未被选中
新图片，再用edit -- convert -- grey scale 8把这张图片转换成八位灰度图片。发
贴: 1432 2. 重新校正光密度，依然把insitent level定为250。这实际上就是扣背景了。
积
分: 132 3.对灰度图片，select color按纽变成了select range。点出的选色窗口只有一个
选上的都是白色区域，测量没有影响。 得
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丁当: 986 4.回去点count按纽，到statistics窗口里察看测量值。IOD的确与上面所作的不
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合肥市口腔医院 招聘 计算机专业硕士研究生
hbchendl
2006-04-07 19:35
下面就是统计问题了。现在我们测量的是整张照片中黄色区域的总光密度值。图片与
最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。此时IOD值就能反映出这两发
贴: 1432 是黄色区域的面积），其平均光密度就是IOD除以图片的整个面积。实际上比较的就积
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• 【原创】上海交大考博成绩出来了
hbchendl
2006-04-07 20:00
另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。因此在计算平均光密度时要把为
IOD/（照片面积-空白区域面积） 发
贴: 1432
照片面积就是照片的象素，一张480*720象素的照片面积是345600。 积
分: 132 空白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在250-255之间，H选30-255，再count
在面积测量中设一个大一点的过滤值就行，比如只计算面积大于200象素的区域。还得
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丁当: 986 如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中
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• 【转帖】“重磅炸弹”黄金时代渐逝 制药业转型求生
hbchendl
2006-04-07 20:10
还有其他的一些复杂情况，没法一一叙述。一句话，测量的IOD是分子的值，一般情片的具体情况进行适当选择。本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）
发
贴: 1432 当切片较多时，制作一个宏操作能大大省时省力。
积
分: 132 这有一篇稍微详细一点的讨论免疫组化图片分析方法的参考文献。有两部分，part2
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免疫组化切片分析方法.part1.rar (200.0k) 票: 160
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• 【专题】日本核泄露有多恐怖？如何应对核辐射？核医学专家解读报道集锦
我还想活下去
2006-04-18 22:10 再次感谢楼主了
丁香园准中级站友 发贴: 积分: 得票: 丁当:
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燕达国际医院 招聘 软件工程师
102 10 315
balake
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2006-04-21 07:20
我目前紧急需要IPP5.1 的中文说明书，不知哪位大哥可提供？感激不尽！ 11 请发:********************.cn
或者QQ：531910818 0 谢谢！
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• 【讨论】366浙大消化被刷。。。可怜的同学
hbchendl
2006-06-27 11:58
制作宏的操作： 一、准备工作：
发1。进行光密度较正。命名保存，如system。 贴: 1432 2。在count/size窗口中设置： 积measurement:area(10-10000000),IOD(0-100000000)
分: 132 option: outline:none, label style:none .clean border:none 得然后点file --save setting，保存该设置为一个文件date.evn，文件位置最好是分票: 160 3。在select color 里选HIS:H 0-30,S,I0-255，然后点下面的file按纽，save c丁当: 986 二、录制宏：
打开图片，点开count/size窗口，先随便测个数据，这样可以打开view--statist 博
现在桌面上有光密度较正窗口、count窗口，数据统计值窗口和图片窗口，以此为运客空间
点宏--录制宏，先起个名字，指定一个快捷键。然后开始录制。注意以下的所有操作
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1。在intensity caliberation窗口中选上已保存过的较正曲线名，注意一下曲线是类）
2。点count/size中的file--load setting，调出刚才保存的date.evn文件。 3。点select color，在调出的窗口中点HSI，再点load file,调出rgb24.rge文件4。仍然在segmentation窗口中下方的preview中选择 all class 和transparent色。
点creat preview image复制下这张preview图片。
5。在新图片上点一下，再点程序菜单上的edit---convert to --gray scale8。又
点录制宏小窗口的stop结束。
把这张黑白图片保存。关闭其他的图片，打开Excel,然后开始录制另一个宏： 1。开始录制后依然先点一下intensity caliberation 的那个校正。 2。调出count窗口的setting文件。
3。点select range。将range范围选为：0-背景值（这个背景值就是在校正背景时4。回到count中点count按纽。
5。到statistics窗口中点file DDE to Excel. 6。结束宏的录制。
说明：由于中间会建立新文件，所以这一步的宏操作常出错。只好分成两步作宏操作宏操作录制完后，处理图象时的操作：
1。打开一个图片，运行第一个宏。得到一张灰度图片。 2。对灰度图片执行第二个宏操作。 3。在excel中把数据转移或抄下来。
4。先打开下一张要处理的图片，再关闭掉上一张图片。（桌面上不能一张图片也没5。开始处理下一张图片。
图片测量数据的处理：
测量指标要根据图片的情况来选择。各有不同的选取。 可以：
仅比较整张图片的IOD。
比较阳性区域的density mean=IOD(sum)/area(sum) (这里的area是黄色部分的ar有时图片上仅有部分区域有样品，还有大片区域是空白。这就需要另外测量样品区域单个细胞可以比较每个细胞的IOD 或者是 单个细胞IOD/单个细胞area. 这些其他的情况都需要重新制作宏。
免疫组化切片分析方法.part2.rar (176.06k)
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LabScribe记录及分析软件——香港生科仪，您最好的选择
shelb352
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2006-06-29 00:01
陈老师，能不能帮我看一下是错在哪，我在录制第一个宏后，对同一张图片，运用宏
264 过，没有错的。
以下是应用宏后的灰度图： 11 3 154
0票 票数 举报 优秀国产医学统计软件，非统计专业医药工作者科研好帮手！ shelb352 发贴: 积分: 得票: 丁当: 2006-06-29 00:06 这是不用宏，对同张图片通过与宏相同步骤生成的灰度图： 264 11 3 154 0票 票数 举报 北京众安康中医骨科医院 招聘 网络推广 hbchendl 2006-06-29 09:15 发贴: 1432 积分: 132 得票: 160 手把手教你使用IPP第二版。 对不同的图片，宏操作各有不同。所以我那个宏操作只对我的示例图片有效。处理别没见到原照片时无法判断楼上两个图是哪个有错。先把原图片帖上来吧。 0票 票数 丁当: 986
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• 【原创】国家复试分数线下周二下午三点出来，据线报A区285，BC线没准确消
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shelb352
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2006-06-29 20:52
陈老师，首先很感激您！
264 以下是我的原图，对这张图我用宏和不用宏得到的灰度图相差很大，不知咋回事？ 11 3 154
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• 【求助】弱弱的问一句，近两年中药新药批的只有几个对吗？
shelb352
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2006-06-29 20:59
另外我想问一下，关于宏的录制，对两个保存的文件里设的值是否需要通过对几张图
264 11 3 154
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• 【原创】上海交大考博成绩出来了
camell
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2006-06-30 00:09
借用shelb352的图, 源图中相机的Gamma值约在0.6左右, Gamma这非线型曲线如何68 如果灯源电压一定但调在高电压或低电压上灯的色温不同, 对同一组化样品光透过率不
所以请大家在理论还不成熟时最好用经典的光密度尺校准的方法, 以免出错. 4 0 100
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• 【推荐】好消息！JP XVI（日文版）正式发布了，快去下载哦！ 2006-06-30 11:46
hbchendl
第二张图是对的。
生成预览图时点的是选色窗口中的名字叫“creat preview image”的按纽。而不是
发
贴: 1432 关于选色阈值，一般是0-30左右，可以根据自己图片的情况稍作调整，30这个值可
最后分析时只能取相同的一个值。 积
分: 132 在第二个宏里选的range则可以简单地取0-背景值。不要调整。
得
票: 160 楼上说的事让我糊涂。
丁当: 986 我只知道拍摄照片时要用纯正的白色光，光源电压不能乱调。只有一个正确的光源电
博
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